等电聚焦电泳色谱仪分离技术介绍（二）
8、载体两性电解质pH值梯度不稳定的原因：
阴极漂移是指在等电聚焦电泳中pH梯度的碱性端逐渐消失的过程。反之，如果其酸性端逐渐消失则称为阳极漂移。
为了阐明等电聚焦电泳中pH值梯度不稳定的机制，提出了各种假说：
（1）载体两性电解质向阴、阳极的等速电泳迁移。
（2）在阴极因CO2的吸附而引起阴极液组分和浓度的变化。
（3）在pH梯度的中性区域生成一段纯水，水的等电聚焦导致水在电泳柱中的聚集并向两端反流。
（4）不同等电点的载体两性电解质的选择性缺陷而引起不稳定。
（5）载体两性电解质带电配体的结合或分离而引起不稳定。
（6）载体两性电解质相互反应的存在而引起不稳定。
（7）相对迁移的氢离子和氢氧根离子浓度的不平衡。
9、注意事项：
（1）pH梯度的选择。
（2）添加中性载体两性电解质。
（3）电流降到最小且恒定时尽快结束电泳。
（4）电泳结束后，检测凝胶表面pH。
（5）蛋白质在pI处形成沉淀，添加表面活性剂。
二、固相pH梯度等电聚焦电泳：
固相pH梯度等电聚焦电泳比载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达0.001pH，是目前分辨率zui高的电泳方法之一。
1、工作原理：
蛋白质分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中迁移，达到自己的等电点时停止迁移。
2、固相pH梯度的介质：
固相pH梯度（IPG）的介质是Immobilines试剂，是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，聚合行为与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺相似。
3、固相pH梯度的形成：
Immobilines试剂的分子式为CH2 = CH－CO－NH－R，其中R代表羧基或第三氨基，每个分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连。分子一端的双键可在聚合过程中共价键合镶嵌到聚丙烯酰胺介质中，是固相的，即使是在电场中也不会漂移。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围，可形成近似线性分布的pH = 3～10的缓冲体系。通过这种方式形成的固相pH梯度胶条不会发生电渗作用，可进行特别稳定的等电聚焦电泳分离。
固相pH梯度介质不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变。
4、固相pH梯度的选择：
常用方法是先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，通过实验确定。
5、固相pH梯度胶条的泡胀：
泡胀的实质是让样品能完全以可溶形式进入固相pH梯度胶条内，从而能进行等电聚焦电泳分离。
6、聚焦时间的优化：
理论上讲，获得最好的电泳谱图质量和重复性所需的zui优时间是等电聚焦电泳分离达到稳定态所需的时间。
聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽不会导致蛋白质向阴极漂移，但由于活性水转运会导致过多水在固相pH梯度胶表面渗出（电渗），而造成蛋白质谱图变性，在胶条碱性端产生水平条纹和蛋白质丢失。
实际工作中，应根据蛋白质样品、上样量、pH范围和胶条长度，通过实验确定zui优时间。
7、影响固相pH梯度胶条的蛋白质载样量的因素：
（1）待分析蛋白质的量应满足质谱分析。
（2）如果只是为了得到一张好的电泳谱图，则无需考虑太多其它因素。
（3）待研究蛋白质的丰度。
（4）对于较复杂的样品，为了尽可能了解所包含的每种蛋白质，需要反复实验才能完成。如果将待测样品富集，则更易分析。
（5）固相pH梯度胶条的pH范围。
8、特点：
（1）优点：
1）固相pH梯度可窄至0.1pH，分辨率极高，可达0.001pH。
2）pH梯度稳定，不漂移。
3）灵活性大，可随意选择pH梯度和斜率。
4）重复性好。
5）加样量大。
6）样品中盐的干扰小。对碱性蛋白质能很好的分离，无边缘效应，可用很窄（如5mm宽）的胶条聚焦，特别适合于双向电泳的*相。
（2）缺点：
1）固相 pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
2）电泳时需用高电压，电泳时间长。
3）窄范围pH测定困难，只能计算。
9、注意事项：
（1）温度：20～30℃。
（2）电压：梯度上升。
（3）需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白质。
三、应用：
分离对象只限于蛋白质和其它两性分子。
常用于同工酶的分离分析和pI测定。
