植物培养与转化
实验概要
本实验介绍了由农杆菌介导的植物转化方法。
主要试剂
LB培养基，5%蔗糖溶液，0.02% Silwet L-77，含0.8%琼脂的1/2 MS (Hygromycin)固体培养基，30uMDex，50uM雌激素
主要设备
人工气候室，4℃冰箱，22℃光照培养箱
实验材料
农杆菌，植物
实验步骤
1. 植物培养
植物生长环境为20-23℃，14小时光照、10小时黑暗的人工气候室。取5-6周大的植物进行各种实验。
2. 植物转化
1) 在含有相应抗生素的LB平板上划线农杆菌，于28℃培养箱中培养24-48小时。
2) 接种单克隆于小管中28℃ 培养过夜，第二天按照1:100转接到250mL液体培养基中，培养20小时。
3) 室温4000rpm离心15分钟收集菌体。
4) 在5%蔗糖溶液中加入0.02% Silwet L-77混匀，用此溶液重悬细菌。
5) 取生长大约6-8周，长势良好的植物，将花序浸没在菌液中2-3分钟。
6) 完成后将植物平放于盆中，并加盖保湿，移到光线较弱处。
7) 第二天揭去盖子，将苗竖起并转移到正常条件下继续培养。
8) 约20-25天后收种子，待种子干燥后进行转化子的筛选。
9) 配制含0.8%琼脂的1/2 MS CHygromycin)固体培养基，将己经干燥的T0代种子表而灭菌后均匀的铺于MS培养基上。
10) 4℃ 冰箱中放置3天后转至22℃ 光照培养箱中培养。
11) 在7-10天后挑选根较长，叶子较绿的植株，移入土壤中培养，再用PCR或者Western鉴定转基因。
在所有包含HopAI1 , HopAI1His102Ala和AvrPto转基因植物的实验中，在处理flg22或者水之前，先用50uM的雌激素诱导12或者24小时。在所有包含MKK5DD转基因植株的实验中，在处理flg22或者水之前，先用30uM的D ex诱导24小时。
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