发根农杆菌诱根现象观察
一、原理
发根农杆菌是一种寄主范围非常广泛的土壤细菌，可以侵染几乎所有的双子叶植物和少数单子叶植物。植物伤口感染发根农杆菌后，一到数周出现毛状根。毛状根没有向地性，除菌后在无激素培养基上可迅速生长并产生许多分枝。通过培养可直接从毛状根上再生植株，或经愈伤组织途径分化出再生植株。发根农杆菌转化系统是实现植物基因转化的又一重要系统。
二、目的
观察发根农杆菌诱发植物产生毛状根的过程，掌握发根农杆菌转化植物的基本方法。
三、材料和试剂
1、烟草实生苗，试管苗，子叶柄，胚轴，叶片，叶柄，茎段等。
2、发根农杆菌野生型菌株。
3、YEB液体、固体培养基。
4、MS液体、固体培养基。
5、微量注射器，塑料袋，解剖刀，无菌牙签，无菌滤纸。
四、操作步骤
1、将发根农杆菌在YEB平板上划线培养。
2、挑取单菌落接种于20ml YEB液体培养基中，20℃，200rpm条件下振荡培养，至OD600值为0.6-0.8。
3、按1％量接种到新鲜的YEB或MS培养液(pH
5.4-5.8)中，需要时也可添加AS（100umol/L）。继续培养至OD值为0.2左右时，可直接用于接种。或当OD值为0.6-0.8时，将菌液转入无菌离心管中，4000rpm离心心5分钟。去除上清液，菌体用新鲜YEB或MS液体培养基稀释至OD值为0.2后用于侵染（需要时可加入100umol/L的AS）。
4、用解剖刀从实生幼苗或试管幼苗顶端最幼嫩的节间处切除幼苗顶部。用无菌牙签从YEB平板上挑取少量细菌接种于切口表面，或用微量注射器吸取菌液，将菌液滴在伤口面，也可用针头刺入叶腋或茎、根的皮层分生组织内，接种极微量的菌液。处理后的实生苗用塑料袋套上，以防伤口干燥。
5、从实生幼苗或试管幼苗上剪取子叶、子叶柄、胚轴或叶片（叶片中是剪2－3个剪口）、叶柄、茎段（实生离体材料需经消毒处理）置无菌小培养皿中，加入适量菌液，轻轻摇动一下，浸泡1－10分钟（视具体材料而定）。取出置无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入不含激素的MS培养基中进行共培养。
6、将处理后的植株及共培养材料置适宜条件下培养，2－4周后创口面或注射部位开始长出毛状根。
