Q Exactive中TMT定量工作流程的参数优化和Proteome Di...（三）
4. 工作流程设置和定量比值的定义
首先在 workflows tab 下打开 Processing Workflow。模板里已经包含了质量数容许偏差、报告离子定量分析说明和常见修饰，只需要再细化以下几个参数。
1. 在 Processing Workflow 的 SequestHT 节点下，选择 Protein Database。可同时选择多个蛋白质数据库。
2.
在 Processing Workflow 的 SequestHT 节点下，指定 TMT 为肽段氮端和赖氨酸残基上的 static
modification。（请注意：TMTsixplex 和 TMT10plex 都对应 229.163 Da 质量增加）。
3. 在报告离子定量节点下，确认 MS 级别是 MS2。
4. 打开 consensus Workflow ，选择 Protein Marker 节点。选定需要在结果中标示的蛋白质。因为样品是 E. coli 和人源蛋白的混合物，定义两类标志物便于后续分析（E. coli 和人类的） （图 5）。
5.进入
Peptide and Protein Quantifier 节点。将 Apply Quan Value Corrections 设置为
True，Co-Isolation Threshold 设为 50， Average Reporter S/N Threshold 至少设为
10（图 6）。Scaling Mode 选用 On Channel Average （Per
File），这样对于每个平行分析结果来说，其中每个通道的丰度值都会进行按比例缩放。更多关于参数如何设置的细节参见参考文献 11。
6. 将 .raw 从 Input Files 标签下拖到右侧 Analysis 条目下的指定区域内。
7.
进入 Grouping & Quantification
条目并指明研究中的变量。该设置会决定定量分析结果分组和显示的方式。本例中选择了 Quan Channel 和 isolation
windows，因此平行分析的结果会按不同隔离窗口分组并取平均，使其能够非常方便地在最终报告中进行比较。具体操作方式是选定这两个变量，并通过选择每个变量左侧的上下箭头把
isolation windows 移到 Quan Channel 上方。请注意变量的顺序会影响 Bulk Ratio Generation
中的分组方式。选定对照组 130N Quan Channel 作为这两个提取窗口的 Denominator， 再选 Add
Ratios。Generated Ratios 参见图 7。更多关于如何设置研究变量的细节请参见参考文献 11。
8. 点击 Analysis 右上角的 Run，开始运行 Job Queue 中的 Processing 和 Consensus Workflow 搜索。
图 5. 本研究 consensus Workflow 中 Protein Marker 节点处的设置。
图 6. Consensus Workflow 中 Peptide and Protein Quantifier 节点处的参数设置。
图 7. 进行比例计算时 Grouping & Quantification 标签的内容。
5. 蛋白质和肽段鉴定以及定量结果分析
1. 搜索结束后，选亮 Consensus search，选 Open Results。或者进入 Analysis Results 条目，选亮分析行再选择 Open Results。
2. 蛋白质和肽段的分组数量显示在屏幕下方。
3. 对每个蛋白质/肽段组，根据蛋白质标志物节点中设置的物种归属结果也被显示出来（图 8）。
4. 进入工具栏 View 条目，选择 Display Filter。从全部文件中过滤所有被鉴定为源于 E. coli 的蛋白质组和肽段组（图 9）。
5. 要得到两个研究因素中每个因素下的鉴定结果总数，使用如图 10 所示的条件进行滤筛。
6. 要得到可定量的肽段数量，进入 View，选择 Distribution Charts。在 Bar Charts 中选择 Peptide Groups-Quan Info 可以显示有和没有 Quan Values 的肽段组（图 11）。
7. 如 Grouping & Quantification 标签中所设计的，每个条件下的两个平行分析的定量比值被分在一组并取平均，即如 Abundance Ratios 栏所示 （图 12）。此外，Grouped 和 Scaled Abundances，平行分析间的 Standard Error，以及每个平行分析数据组的 Scaled Abundances 都被显示出来（图 13）。这些功能使得对不同条件下的定量分析结果进行比较易如反掌。
图 8. 根据物种来源标识的蛋白质。
图 9. E.coli 蛋白质组（上图）和肽段组（下图）鉴定结果滤筛。
