Q Exactive中TMT定量工作流程的参数优化和Proteome Di...（五）
MS1 参数
TMT 标记对于母离子来说是真正的同量异序标签，因此 MS1分辨能力的设置是与未标记样品完全相同的: 对于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 来说，其分辨率分别为 70,000 和 120,000。这样的设置足以在不显著影响数据依赖扫描模式循环时间的前提下，分辨绝大部分共洗脱物质。 推荐 AGC 目标为 3e6，有利于提高全扫的动态范围。
MS2 分辨能力
MS2 分辨能力不够会导致背景或杂质离子信号与报告离子信号混为一谈，影响对 S/N 的评估。对于 TMTsixplex 标记的样品来说，分辨率设置为 30,000 能够保证报告离子与相近报告离子的同位素峰实现基线分离。12
对于 TMT10plex 试剂来说，13C 和 15N 同位素异构体的质量差异仅为 6 mDa。图 15 中显示的是不同比例下经 4 通道 （128N，128C，129N，129C）标记的肽段的报告离子区域。30,000 的分辨率设置不足以区分 N 和 C 同位素异构体。对于 TMT10plex 标记的样品，合适的 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS分辨率设置分别应为 35,000 和 60,000。
图 14. 分析 TMTsixplex 标记的 E. coli 和 Hela 混合样品时，增加进样量和梯度洗脱时间后可鉴定和可定量的 E. coli 源肽段和蛋白质的数量。
图 15. 分辨率设置分别为 30,000，35,000 和 60,000 时，TMT10plex 标记肽段报告离子区域细节图。请注意，在 30,000 分辨率下仅得到部分分离。
MS2 最大注入时间
MS2
最大注入时间需要根据进样量、样品复杂程度和洗脱梯度进行调整。通常来说，更长的注入时间能够积累更多的母离子，报告离子的强度会相应增加，更有利于中低丰度肽段的鉴定和定量分析。如图
16 所示，最大注入时间从 64 ms 增加到 100 ms 大大提高了可定量蛋白质和肽段的数量，也相应地实现了更高的定量分析率。
如前所述，更长的洗脱梯度需要更长的注入时间。另一方面，注入时间的增加不应该显著影响仪器的整体速度，尤其是在分析复杂样品的时候。一个理想的方法是将可允许的最大注入时间设成与
FT 转换检测时间匹配，因为该时间是与仪器分辨率设置直接相关的。对于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF
MS 来说，128 ms 的 Orbitrap 分析器检测时间对应的分辨率分别是 35,000 和 60,000，因此使用 100 ms
的注入时间与检测时间非常匹配，能够保证离子注入与 Orbitrap 检测的高效并行。如图 17
所示，增加注入时间同样有利于提升定量检测的准确度。
图 16. 使用不同仪器设置时，纯 E. coli 样品中可鉴定和可定量肽段和蛋白质组的数量。*方法设置详情参见表 5。
表 5. 图 16 中比较的每个方法的详细参数。
MS2 IT | MS2 AGC | MS2 NCE | |
Method 1 | 64 ms | 5e4 | 30 |
Method 2 | 100 ms | 5e4 | 30 |
Method 3 | 100 ms | 1e5 | 30 |
Method 4 | 100 ms | 1e5 | 32 |
