Q Exactive中TMT定量工作流程的参数优化和Proteome Di...（四）
图 10. 运用本研究中每个研究因素筛选蛋白质组（上图）和肽段组（下图）鉴定结果的滤筛。
图 11. 筛滤后肽段组的定量分析结果总览。
图 12. 结果中的 Abundance Ratios 栏。比值分别按 Isolation Windows 和 Quan Channel 排序。比例上调或下调的蛋白质用不同颜色高亮显示。颜色越深代表变化程度越显著。
图13. 每个数据组中蛋白质的丰度（Abundances （Grouped））、标准误差（Standard Errors）、折合丰度 （scaled Abundances）的图示说明。
结果与讨论
仔细设置每个质谱分析参数对基于
TMT-标记实验实现绝对灵敏和准确的定量分析至关重要。一般来说，更长的梯度能够提供更好的色谱分离效果、更小的离子抑制效应以及更少的共洗脱物干扰情况。高度分辨的
MS1 和 MS2 谱图对于准确的肽段和蛋白质相对定量结果的获取不可或缺。MS2 最大注入时间、AGC、NCE 以及 MS2
隔离窗口等仪器参数的设置都会影响 MS/MS 谱图的质量和定量结果。因此在保证仪器高采集速率的同时，应当慎重地选择这些参数。
液相色谱
肽段的化学修饰会影响其疏水性，从而改变其色谱保留行为。TMT-标记样品的洗脱通常需要更高比例的有机相。表 3 和 4 分别提供了对未标记和标记的细胞裂解液样品进行色谱分离的推荐梯度，总梯度时间为 2 小时。
表 3. 未标记样品的 LC 梯度。
时间 | 时长 | 流速 | %B |
0 | N/A | 300 | 2 |
5 | 5 | 300 | 2 |
105 | 100 | 300 | 20 |
125 | 20 | 300 | 32 |
126 | 1 | 300 | 95 |
134 | 8 | 300 | 95 |
表 4. TMT 标记样品的 LC 梯度。
时间 | 时长 | 流速 | %B |
0 | N/A | 300 | 5 |
3 | 3 | 300 | 5 |
5 | 2 | 300 | 7 |
105 | 100 | 300 | 25 |
125 | 20 | 300 | 60 |
126 | 1 | 300 | 95 |
134 | 8 | 300 | 95 |
随着样品复杂度增加，洗脱梯度也应相应地加长（e.g.，4 小时）以保证更好的色谱分离。然而加长洗脱梯度又不可避免地会导致色谱峰变宽以及母离子 S/N 降低。因此应当考虑增加进样量或是提高最大注入时间的限制。最终用于评价实验效果的指标应当是可定量肽段的数量，而所谓可定量肽段是指碎片谱图包含所有预测报告离子峰的那些肽段。如图 14 A 中所示，对于 1 μg 进样量，将洗脱梯度的时间从 2 小时增加到 4 小时，鉴定出的肽段数量从 3,241 个增加到了 3,810 个。鉴定结果显然受益于分离效果的改善，因为对低丰度肽段的检测灵敏度增加使得蛋白序列覆盖率也相应地提高了。另一方面，可定量肽段数并没有增加，因为最大注入时间设置与 2 小时的梯度相同（表 2）。如果在加长洗脱梯度的同时将进样量增加到 2 μg，则增加了 400 多条可定量肽段，将肽段的可定量数/可鉴定数所占比例提高到了 85%。同样地，可定量蛋白质组数也随着色谱梯度时间和进样量的共同增加而增加（图 14B）。这一结果说明，对于高动态范围的样品（20:1），实现色谱分离条件、进样量和最大注入时间的最佳匹配才能取得可靠的定量分析结果。
