protocol：小鼠胚胎干细胞培养实验方法和操作步骤-3
体外分化方法
第1步：ES培养基
在LIF存在的条件下维持细胞培养
第2步：EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1、分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）
2、纯化 2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3、用2mlEB 培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
4、一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5、2天后更换培养基。将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6、用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
第3步：ITSFn培养基
在最少量培养基中选择神经前体细胞
1、在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基
2、并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3、保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
第4步：N3培养基＋bFGF
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1、PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶
2、 37℃孵育5分钟
3、用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4、将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5、将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板 1.7×106/孔。
6、2天后更换培养基
第5步：N3培养基
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化
1、细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基
2、根据需要换液（大约每隔一天）
3、分化10～15天后固定细胞
移除培养基
PBS洗涤
加入4%福尔马林
室温放置30分钟
PBS洗涤2次
储存于 PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS
移植细胞的准备
细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。
移植
1、将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。
2、去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中
3、离心3分钟
4、去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）
5、37℃水浴5分钟
6、加入5mlEB培养基小心吹打约10次
小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
7、离心2分钟
8、吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基
9、用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10、离心2次
11、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基
烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
1、准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）
2、加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）
3、将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）
4、如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液
5、将悬液置于室温（或冰上）30分钟
6、离心2分钟
7、吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基
8、重复一次
9、离心2分钟
10、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。
