小鼠胚胎干细胞培养实验步骤（二）
Geltin（明胶）包被
准备500ml 0.1％geltin溶液
1．将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
2．置室温30分钟；
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代
建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
1．去除培养液；
2．无钙镁PBS（Gibco）洗涤；
3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。
4．加入ES培养基使胰酶失活；
5．将细胞转入15 ml离心管中离心3min；
6．去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。
7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；
8．将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）
9．建议按1：4－1：10的比率传代 (ATCC)
保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。
体外分化
胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
时间线（总时间为27～34天）
第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天
体外向心肌细胞方向分化
胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。
培养基
EB
配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml
离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml
FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。
贮存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）
PEST（P104U/mlS104μg/ml
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