李斯特氏菌聚合酶免疫检测方法
聚合酶免疫检测方法
用酶免疫方法检测食品中的李斯特氏菌，从20世纪80年代末到90年代初已有许多商品化产品供应于市场。
AOAC 公定方法996.14可应用于检测在乳制品、红肉、猪、禽类产品、水果、坚果、海产品、意大利面制品、蔬菜、奶酪、动物肉类、巧克力和蛋品中的单增李斯特氏菌及其他李斯特氏菌的检测。
1、原理
Assurance ®多克隆酶联免疫分析（EIA），将对单增李斯特氏菌和其他李斯特氏菌抗原有高度特异性的抗体固定在微孔内壁上。经增菌培养后的样品和阳性对照加到检测板的微孔内。如有李斯特氏菌抗原存在则在微孔内形成抗体抗原混合物。没有反应的样品物质被冲洗掉。加入抗李斯特氏菌特异抗体，重复孵育、冲洗程序，然后加入碱性磷酸酶接合剂，使酶与李斯特氏菌抗原相结合，孵育后，没有结合的接合物质被冲洗掉，加入底物显色，用405～410nm的光学测量仪读数，计算临界值。可疑阳性结果须经培养方法证实。
2、培养基和试剂
①洗液、浓缩液 2％的吐温-20水溶液。
②底物片剂 5mg ρ-磷酸硝基苯片剂。
③底物稀释液 1mol/L二乙醇胺水溶液。
④阳性对照 稳定的无活性的李氏菌抗原。
⑤抗体溶液 能与李斯特氏菌抗原起反应的高纯抗体。
⑥接合剂 碱性磷酸盐抗体接合剂。
⑦终止液 20％的 EDTA 水溶液。
⑧包被有抗体的微量孔板 每孔都包被有李斯特氏菌的抗体的试条，96孔的托架和盖子。
⑨加 LiCl 的改良 Fraser 肉汤(mFB+ LiCl) 55g 商品用 Fraser 肉汤基础加1L 水搅拌至完全溶解（注意：不要加热溶解）。当粉末完全溶解后，加4g LiCl 搅拌至完全溶解。121℃，15min 高压灭菌。或者按以下方法制备45％ LiCl 溶液：将45g LiCl 加入100mL 容量瓶内，加纯净 H2O 溶解后，用纯净 H2O 稀释到100mL；用0.2μm滤皿过滤灭菌LiCl 溶液，加2mL 灭菌的 LiCl 溶液到225mL 已灭菌的 mFB 内。不要加柠檬酸铁胺（ferric am-monium citrate）到 mFB＋LiCl 肉汤内。
⑩缓冲的李斯特氏菌增菌肉汤（BLEB） 溶解36.1g商用Lis增菌肉汤，8.5g（3-［N-morpholino］propureesulfonic acid）（MOPS）和13.7g的 MOPS 钠盐。于1L纯净H2O中，加热溶化混匀。121℃，15min 高压灭菌。
①诊断试剂 EIA 阳性结果需要培养确证。（参见 FDA《细菌分析手册》现行版或其他标准检测方法的单增李氏斯特氏菌部分）。
①～⑧可从BioControl Systems Assurance ® Listeria酶免分析试剂盒。
3、仪器
①培养箱 30℃±1℃和35～37℃。
②水浴 100℃±2℃或用设在100℃的流动蒸汽高压锅代替。
③微量板清洗器 用于清洗微量孔试条。可用洗瓶代替。
④微量板读数仪 备有405～410nm 滤光器的光学仪器，能够读微量板，可以选用有打印机的。
⑤微量加样器 精确至100μL 和250μL。
⑥涡旋振荡器。
⑦称样天平 称取测试样品。
4、通则
所有试剂必须贮存在2～8℃在使用前放置室温，每测试一份样品，包括2个阳性对照和1个空白测试孔。每一样品和试剂均使用单独的吸嘴以避免交叉污染。同一试剂盒内容物均作为一个整体单位使用，不要与其他标号或其他产品混用。每一试剂均使用其专用的试剂或玻璃器皿以避免交叉污染。不要用已过期的试剂，不要重复使用微量板。
5、样品制备
增菌无菌称量25.0g 样品到225mL mFB＋LiCl 中混匀（如果分析的样品量较大按1：9稀释倍数适当增加 mFB＋LiCl体积），30℃培养28h，吸取1mL 培养后的 mFB＋LiCl 到90mL BLEB 管中，30℃培养24h。
培养完将培养物混匀，放置1min 让颗粒沉淀，然后吸取1mL 到试管内，冷藏保存增菌肉汤以备阳性结果进一步鉴定。
将试管浸入沸水浴中15min 以灭活细菌。将试管冷却到25～37℃后测试煮沸过的样品在测试前可在2～8℃贮存4天。（注意：贮存过的试管样品在加入微量孔内前要混匀）
6、酶标分析
①准备以下试剂，在测试前放置至室温。
洗液1.0mL 的浓缩洗液，加100mL H2O（足够洗48个孔），做好标记。洗液可在2～8℃贮存30天。
酶底物溶液加1片酶底物片剂到5.0mL 底物稀释液中（足够48个孔用），做好标记使用时需即配即用，未用完的弃去。
②设置405～410nm 滤光片于读板仪中。
③取需要量的微量孔板条，放入架内，要有2个阳性对照和1个空白。将未用的微量孔板条放回有硅胶干燥剂的箔带封好。清楚地标记好阳性对照、空白和样品在架子上的位置。
④在滴入微孔前将测试样品5和阳性对照用涡旋振荡器逐一混匀。吸取100μL 测试样到样品孔内，吸取100μL阳性对照到每个阳性对照孔内，“空白”孔不要加任何物质。
⑤用提供的塑料盖盖上微孔板。35～37℃培育3min。在培育时不要在微孔板架上堆任何东西。
⑥用下面a或b的方法清洗每个孔3次（注意：足够的清洗次数是获得精确结果的条件）
a.由微量板清洗器完全去除孔内的内容物，立刻用洗液（大约250μL）充满各个孔。重复上述步骤3次。不要将洗液溢出孔外，避免清洗不彻底或产生交叉污染。
b.倒转微孔板，倒掉内容物，并将平板用力拍干，立即用清洁的洗瓶内的洗液将孔充满，重复2次。
⑦在最后一次清洗后，立即将抗体溶液混匀（轻轻倒转盖子几次），加100μL 抗体到每个孔内（包括对照和空白）。盖上塑料盖于35～37℃培养30min。
⑧按步骤⑥洗每个孔3次。
⑨在最后一次清洗后立即将接合剂混匀（轻轻倒转瓶子几次），加100μL接合剂至每孔内（包括对照和空白），盖上盖子于35～37℃培养30min。
⑩按步骤⑥清洗每个孔3次。
⑪在最后一次清洗后立即加100μL 底物溶液到每个孔内（包括对照和空白），盖上盖子于35～37℃培养30min。培养后立即进入读数，如果未能及时读数，加50μL 停止液到每个孔内并在1h 内读数。
7、读数
在405～410nm 处读对照和样品的吸收值A。在读对照和样品前用空白校准读数仪。用空白孔的光密度值（OD）调节标定读数器为零，开始测试样品前先读2个阳性对照孔。（注意：样品的数值可能＜0，这并非不可能，它表示阴性结果）。
8、结果判断
①对照值 阳性对照读数值应＞0.8OD单位。在这个以下表示清洗过程有问题。如果读数值小于0.8OD，重复测试步骤6中③，或与试剂公开联系。如果读数值超过读数仪的上限，用2.5的读数值计算临界值。
②临界值 计算两个阳性质控的平均 OD 值，再乘以0.25得出临界值。
③阴性结果 样品的 OD 值小于临界值为阳性。
9、阳性EIA样品的鉴定
当样品的数值≥临界值时为阳性结果，必须用《细菌分析手册》现行版描述的培养方法来确证。用冰箱保存的增菌肉汤分离菌株。
