从培养细胞中分离的细胞核制备成的提取物在体外转录和mRNA加工中具有精确的功能,(1)纯化蛋白质(2)核提取物。
实验方法原理 | 通过向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后,可以降低蛋白质的溶解度,使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析,是物理变化,可复原。对于特定的蛋白质,影响蛋白质盐析的主要因素:无机盐的种类、浓度、温度和PH值。 |
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实验材料 | 哺乳动物 |
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试剂、试剂盒 | PBS低渗缓冲液低盐缓冲液透析缓冲液 |
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仪器、耗材 | 转子离心机电导计透析膜匀浆机离心管 |
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实验步骤 | 1a. 收集转瓶培养的细胞:将浓度为5~10x108细胞/l 的培养液用1 L 的塑料瓶1 850 g 离心20 min,将细胞收入50 ml 锥形离心管中(每管收2~3 L 培养液中的细胞)。进行步骤2。 1b. 收集单层培养的细胞:单层细胞长满后去掉培养液。用PBS洗1次。将细胞刮入新鲜PBS液里,倒进锥形离心管中。进行步骤2。 2. 1 850 g 离心10 min。
3a. 转瓶培养细胞:测量压紧后细胞的体积。将细胞重悬于约5倍于其pcv的PBS液中,1 850 g 离心10 min。进行步骤4。
3b. 单层培养细胞:测量pcv,进行步骤4。
4. 快速地将沉淀的细胞重悬于5倍体积的低渗缓冲液中,1 850 g 离心10 min。将细胞沉淀重悬于3倍于原pcv的低渗缓冲液中,放置在冰上10 min,让细胞肿胀。 5. 在Dounce氏玻璃匀浆器中用B号研杵缓馒上下抽提10次以上。用台盼蓝染色排斥法在显微镜下检査细胞裂解滑况(应大于80%~90%)。
6. 3 300 g 离心15 min,保留上清用来制备S-100细胞质提取物。
7. 测量第6步离心沉淀的压紧后的细胞核体积。用1/2 pnv体积的低盐缓冲液重悬细胞核(必要时用Dounce氏玻璃匀浆器匀浆一次)。
8. 在轻轻搅拌的同时,逐滴加入1/2 pnv体积的高盐缓冲液。终浓度应约为300 mmol/l。 9. 25 000 g 离心30 min,测量核提取物的电导率(用上请,见步骤10)。
10. 将核提取物加入透析管中,在50倍体积的透析液中进行透析,直到提取物的电导率和透析液一致为止(当提取物的KCl浓度达到100 mmol/l 时)。尽量缩短透析时间。 11. 将提取物从透析袋中移出45 000 g 离心20 min。 12. 用Bradford分析法测定上清中蛋白质的浓度。分装,浸入液氮中速冻,- 80℃保存。 收起 |
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注意事项 | 所有步骤的操作均在0〜4℃进行,在冷室内操作更好。缓冲液和设备要预冷。所有离心均在4℃进行,转子要预冷。 |
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其他 | 细胞核提取方法的优化:
1. 按基本方案中歩骤1~7操作。 2. 将细胞核悬液分成5等份。在冷室内不断搅拌,按如下方法在每份悬液中加入1/3体积髙盐缓冲液,在第1份中加浓度最低(0.8 mol/l)的高盐缓冲液,其余各份中依次加入KCl浓度逐渐增髙(直到1.6 mol/l)的高盐缓冲液。轻轻混合30 min。 |
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