细胞传代实验_消化法
| 实验方法原理 | 用胰蛋白酶消化细胞，用于贴壁细胞传代培养。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、传代前准备
1. 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2. 用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3. 正确摆放使用的器械，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4. 点燃酒精灯，注意火焰不能太小。
5. 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6. 取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7. 从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8. 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
9. 稍微摇摇，然后从对侧倒掉培养液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精灯。
二、胰蛋白酶消化
1. 加入消化液：用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，然后让其停止消化。
3. 倒掉消化液加入培养液，弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液。注意要在对测加入培养液。
三、吹打分散细胞
2. 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10 ml 离心管中。
3. 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1 000转/分钟离心5分钟。
4. 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2 ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
四、分装稀释细胞
1. 分装：将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5x105/ml，最后要做好标记。
五、传代培养
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+，占50%为++，占75%时为+++。 展开 |
| 注意事项 | 1. 严格的无菌操作
2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附：0.25% 胰酶（胰蛋白酶，Trypsin）
配方：100 ml PBS，0.25 g 胰酶。
步骤：先配100 ml PBS。 称胰酶0.25 g。加入PBS中，低速搅拌。调pH7.4。过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完。
注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活；对难消化的细胞，在上述配方中，加入0.02 g 的EDTA（0.02%） 展开 |
| 其他 | 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）、贴壁生长细胞传代。 培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。 |
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