逆流色谱法实验操作及影响因素
实验操作
在进行分离纯化时，首先将固定相充满于色谱柱，而后色谱柱即围绕自身轴进行自转；同时围绕设备中心轴进行高速公转(即行星式运动)，再将流动相泵入色谱柱。在此之前，首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相，并将其充满螺旋管柱，然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转，同时以一定的流速将流动相泵入柱内。在体系达到流体动力学平衡后(即开始有流动相流出时)，将待分离的样品注入体系。进样时，将样品组分溶于一定体积的的流动相之中，其组分将依据其在两相中分配系数的不同实现分离。同时，在注入固定相和流动相前，需配制溶剂系统，充分振荡后静置过夜；分离上下层溶剂，超声排气30min。而测试结束后用氮气将固定相推出, 可测得保留率，有时由于固定相的流失导致流出液乳化，一般要求固定相的保留值大于50%。
影响因素
由于高速逆流色谱是无需任何固态载体支撑的液-液色谱,其中作为固定相的液体在色谱柱中的保留程度对于高速逆流色谱的分离过程是十分重要。首先，所选择的溶剂体系对固定相保留率有很大的影响，如两相密度差、粘度、界面张力等。两相的密度差对固定相保留率的影响最大，固定相保留率和密度差基本呈线性关系。其次，还存在一些人为可以操控的条件会对固定相保留率产生影响，如高速逆流色谱的转速、流速、以及柱温等。其中，螺旋管柱的转速以及它产生的离心力场对两相的混合程度具有决定性的影响。因此，对于界面张力较高的溶剂系统，应使用较高的转速，以使两相之间能够剧烈的混合，从而促进分配和减少质点传递的阻力。对于界面张力较低的溶剂系统，应使用较低的转速，以避免过分混合引起乳化作用，以及固定相的流失。
在流动相流速方面，固定相保留率与流速平方根之间有着线性关系。流动相流速快不利于固定相的保留，且出峰时间太快会导致峰与峰间的分离度较差，而低流速虽然可以满足提高固相保留率的要求，但是分离时洗脱时间太长，且峰形变宽、耗费大量的流动相，故选择合适的流速对整个分离体系非常重要。
仪器的柱温对固定相的保留同样也有着不可忽视的作用，其温度对于亲水性强的正丁醇溶剂体系的固定相保留率影响较大。同时温度升高能改变溶剂的粘度，进而影响两相的分层时间。
在选定了溶剂体系后, 有时需要对三个仪器运行参数(转速, 流动相流速, 进样体积)进行正交试验, 以确定最佳分离条件。分离是一种较为复杂的动态高速分配过程，其分离效率不仅和溶剂系统有关，还受分离温度、螺旋管转速、流动相流速、梯度洗脱模式及进样量、进样方式等因素的影响。
