逆流色谱法溶剂系统
溶剂体系的要求及分类
HSCCC是利用溶质在不同溶剂中的分配的分配系数不同进行分离的，所以在溶剂选择时要重点考虑溶质在两溶剂中的分配系数，那么其分离物质的关键是溶剂系统的选择。对于分离的溶剂体系, 应该满足以下几方面的要求：1)不造成样品的分解与变性，且不与之发生反应；2)对样品有足够高的溶解度；3)样品在溶剂体系中有合适的分配系数值(K应在0.5-2之间)；4)溶剂体系的各组分应分成体积比例适合的两相, 以免浪费溶剂；5)固定相能实现足够高的保留，且要满足一定的要求(保留值越大峰形越好)。因而准确测定待分离组分在两相中的分配系数，便可选择出合适的溶剂系统。
常见的溶剂体系按极性分类有以下几种：1) 强极性溶剂体系；2) 中等极性溶剂体系；3) 弱极性溶剂体系；4) 极弱极性体系(无水体系)；5）加酸体系等。这五种溶剂体系分别可以用于分离相应性质的天然产物。
1、强极性体系
正丁醇体系：该体系的基本两相由正丁醇和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于正丁醇和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入甲醇、乙醇、丙酮作为调节剂，组成三元溶剂体系。该体系一般不是很常用。
醋酸乙酯体系：该体系是HSCCC分离常用的体系之一，基本两相由醋酸乙酯和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于醋酸乙酯和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入甲醇、乙醇、正丁醇作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。用该类溶剂系统分离的物质基本上都属于苷类， 且大多数苷的苷元都比较简单，多数含有多个羟基，有的苷含有多个糖，常用于分离黄酮苷、苯丙素苷以及一些皂苷。最常用的溶剂体系有：醋酸乙酯-正丁醇-水、醋酸乙酯-甲醇-水、醋酸乙酯-乙醇-水、醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水。这些常用的体系极性相差不大，只有醋酸乙酯-乙醇-水的极性稍微小点，不常用于分离含有多个糖的苷。
2、中极性体系
甲基叔丁基醚体系：该体系的基本两相由甲基叔丁基醚和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于甲基叔丁基醚和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇、乙腈作为极性调节剂，组成四元溶剂体系，三元的甲基叔丁基醚体系不是很常见。可以用于分离含羟基不是很多的苷类和极性较大的萜苷，以及含有多个羟基和羧基的非苷类物质。甲基叔丁基醚体系和醋酸乙酯体系的极性相差很小。
氯仿体系：该体系是HSCCC分离常用的体系，基本两相由氯仿和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于氯仿和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。其中运用最多的是氯仿-甲醇-水体系，氯仿体系可用于分离含有糖的苷, 也可分离不含有糖且含有一些羟基的苷元。但是甲醇在溶剂体系中的比例很接近或者大于氯仿在溶剂体系中的比例时，氯仿-甲醇-水体系可以分离含有多羟基的苷类物质，其极性甚至可以达到与醋酸乙酯体系极性似的程度。常用于分离黄酮、苯丙素、蒽醌、多酚及其苷。
3、弱极性体系
正己烷体系: 该体系是HSCCC分离常用的体系之一，基本两相由正己烷和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于正己烷和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙腈、氯仿作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。其中运用最多的是正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水、正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水、正己烷-甲醇-水、正己烷-乙醇-水、正己烷-醋酸乙酯-水。一般用正己烷体系分离小极性非苷类物质，被分离物质中极性基团很少。常用于分离黄酮、苯丙素、蒽醌和一些萜类化合物。其中正己烷-甲醇-水、正己烷-乙醇-水分离物质的极性很小，基本不含羟基。而正己烷-醋酸乙酯-水分离的物质极性最大，可以分离含有多个羟基的物质，甚至能分离苷类。而正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水、正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水，这两个溶剂体系的分离极性范围很广。
石油醚体系: 该体系的基本两相由石油醚和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于石油醚和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。其中运用最多的是石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水。用该体系分离的大多数物质都不含有羟基，很少用该体系分离苷类物质，只有当苷元分子较复杂且极性很低时可以用于分离由该苷元组成的苷。降低石油醚的比例，也可以分离一小部分的苷。
4、极弱极性体系(无水体系)
大多数用于HSCCC分离的无水体系都是用乙腈代替水与小极性溶剂组成基本两相，再根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于小极性溶剂和乙腈之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。该溶剂系统可以用来分离极性非常小的物质，这种物质一般含有较多碳，基本上不含有极性基团，适用于分离小极性的甾体、萜类以及多碳烷烃。常见的无水体系有正己烷体系，其基本两相由正己烷和乙腈组成。
5、加酸体系
在极性相对小的溶剂体系中加入酸碱会增大溶剂体系的极性。常在溶剂体系中加入盐酸、醋酸、三氟乙酸、磷酸盐。这种加了酸碱的溶剂体系常用于分离具有酸碱性质的物质，如生物碱、有机酸和酸性较强的黄酮类化合物。氯仿-甲醇-稀盐酸溶剂体系就常常用于分离生物碱类的物质，可以说氯仿-甲醇-稀酸体系是分离生物碱的专用体系。
溶剂体系选择及组分分配系数的测定
选取一个合适的溶剂体系步骤：(1) 通过TLC或者HPLC预测被分离物质的极性。(2) 根据极性选择合适的分离体系。(3) 如果得知与被分离物质极性相似物质的分离体系，可以借鉴。在选择溶剂系统时就需要测定组分的分配系数, 而分配系数测定常采用高效液相色谱法或薄层色谱法，这两种方法都能够较准确地测出特定组分的分配系数值。HPLC法是将适量的样品分别溶于已平衡的两相溶剂，待分配平衡后，进行HPLC的测定，通过得到的色谱峰面积可精确计算出样品在两相间的分配系数。薄层色谱法则是利用样品在等体积上下相中分配平衡后用薄层色谱展开, 通过薄层色谱得到的斑点判断组分的分配情况。不同的体系，有着不同的平衡时间(不同溶剂系统中，从两相溶剂系统的上相与下相溶剂混合时，直到两相系统达到完全分层的时间)，其影响着系统的分离效能，与固定相的保留率密切相关。
如果要同时分离多种物质，首先要预测被分离物质的极性，根据极性的大小来选择分离体系。如果被分离物质的极性都比较大, 可以选用醋酸乙酯体系；如果被分离物质一部分极性大，一部分极性中等可以选用氯仿体系；如果被分离物质一部分极性中等，一部分极性较小可以选用正己烷体系；如果被分离物质极性都较小可以选用石油醚体系 [2]
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