RNA抽提过程介绍
一，准备工作
1， 实验器具与材料:
RNA 抽提
(1) 移液枪:1ml、200ul、10ul
(2) 吸头:1ml、200ul、20ul
(3) 吸头台:放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个 (4) EP管1.5ml、100ul
(5) 玻璃研磨器
(6) 容量瓶:1000ml
(7) 盐水瓶:100ml
(8) 15ml塑料管一个(配75%乙醇用)
2， 实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC 水中(必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水)37°C过夜，然后送至高压 3 次，后在 80°C烘烤箱中烘干(或置于 37°C中 8 小时左右烘干)，试验前将枪头放入吸头台。
(2) 玻璃制品:(主要是玻璃研磨器)
先泡酸过夜，冲洗干净后，在 1‰DEPC 水中泡 8 小时左右，37°C烘干，用蒙锡 纸包裹送至干烤 3 次。
(3) 金属制品:(镊子等)
先洗干净，再送干烤 3 次。(不需要泡 DEPC 水)
3， 试剂配制和准备:
(1) DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在
1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。配 75%乙醇的 DEPC 水的配制:100ml
盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加 40ulDEPC，37°C过夜，送至高压。
(2) 75%乙醇(要在抽提时现配):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙
醇=1:3)，然后放于-20°C备用。
(3) 异丙醇:放入棕色瓶
(4) 氯仿:放入棕色瓶
(5) Trizol:100ml/瓶 存放于4°C
二，抽提时注意事项:
全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三，抽提步骤
1. 匀浆化作用
取约 100mg 鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加 0.2ml 的 Trizol 溶液，研磨组织后，倒 入 1.5mlEP 管中，再在研磨器内加入 0.8ml 的 Trizol 溶液洗，后全部再倒入 EP 管中。 颠倒混匀 10 下，室温静置 5 分钟。
2. 分离阶段
每 1mlTrizol 中加 0.2ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15 秒，使其充分混匀， 室温静置 5 分钟。后 12000rmp 离心 15 分钟。
3. RNA 的沉淀
将上层水相转入新的 1.5mlEP 管中(约 400-500ul)，加入 0.5ml 异丙醇，混匀后放于-20 °C中 1 小时，后 12000rmp 离心 10 分钟。
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6，RNA 的保存
提取的 RNA 保存于-70°C超低温冰箱中，或立即用于逆转录。
组织 100mg
↓
加 1mlTRIzol
↓
匀浆(要彻底，后转至 EP 管) (组织匀浆量>100mg 时分装 1ml/每 EP 管)
↓
颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟
↓
加氯仿 1/5 体积(0.2ml)(必须按总体积的 1/5)
↓
颠倒混匀 15S，室温 5 分钟
↓
4°C，离心 12000rmp，15 分钟
↓
转上层水相(约 400-500μl)于另一新 1.5mlEP 管中
↓
加等体积异丙醇(约 400 -500μl)，混匀后-20°C中 1 小时 ↓
4°C，离心 12000rmp，10 分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的 75%乙醇(用高压后的 DEPC 水配)1ml
↓
4°C离心 7500rmp，5 分钟
↓ 弃上清，超净工作台开风机干燥约 30 分钟(不能完全干燥) ↓
溶于 DEPC 水中至 20μl(10μl-20μl)
(可在 55-60°C水中，<10 分钟助溶)
↓
立即保存于-70°C超低温冰箱中，或立即用于逆转录
细胞 1×107
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4. RNA 的洗脱
小心倒掉上清，留取沉淀。加 1ml 现配的 75%的乙醇(预冷)振荡洗涤 RNA 沉淀一次， 后 7500rmp 离心 5 分钟。
5. RNA 的再溶解
小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干(约 30 分钟，此时 RNA 沉淀变透明)。 注意不能让 RNA 沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。再在管中加 20ul 的 DEPC 水溶解，在 55-60°C下孵育 10 分钟助溶。
TRIzol 法抽提总 RNA
细胞用 1ml 加样 器吹至液体澄清 且无细胞团块
