RNA抽提注意事项和经验指南-4
经典抽提小技巧
1： Phenol 纯化：将等体积的 1:1 Phenol/Chloroform 加入，剧烈混允 1-2 分钟。高速离心 2 分钟。小心取上清
(80-90%)。决不能取到中间层。可以使用等体积的反应液加入 Phenol/Chloroform
中，同样再取出上清。将两次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。混允时不能太温和，也不要试图取出全部上清。
2：70-80% 乙醇洗涤：洗涤时，一定要将核酸悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去。同时，在倒掉乙醇后，立即高速离心数秒，再用移液器去除残留的乙醇。室温静置 5-10分钟后，溶解。
特殊组织的抽提
纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织抽提 RNA 关键在彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，故单位重量的组织 RNA 的含量就少，最好用尽可能多的起始量。一定要在冷冻条件下将组织彻底磨碎。
蛋白/脂肪含量高的组织：脑/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮状物。必须用氯仿再次对上清进行抽提。
核酸/核酶含量高的组织：脾 /胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷冻条件下碾磨组织，再快速匀浆，能有效灭活核酶。但如果裂解液太粘稠
(因为核酸含量高的缘故)，PCI 抽提不能有效分层；加入更多裂解液可以解决此问题。多次PCI抽提可以去除更多残留的
DNA。如果加入醇后马上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，可以去除 DNA 污染。
植物组织：植物组织比动物组织更为复杂。一般，大家都是在液氮条件下对植物进行碾磨的，所以内源酶作用使 RNA
降解的现象不常见。如果降解问题不能解决，几乎可以肯定是样品中的内含杂质导致。许多植物的内含杂质都会导致残留，之所以残留，往往是因为这些杂质与
RNA 有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。这些特点决定了它们是非常强的酶抑制剂。目前，商品化的 RNA
抽提试剂经过小量调整，可以适合几乎所有的动物组织，但却没有一种商品化的 RNA 抽提试剂，可以适合大部分植物组织。
样品冻融的影响
冷冻的样品可能较大，用于抽提 RNA 之前，需要切割。切割过程中样品往往出现融化 (可能是部分融化)。冷冻的样品抽提 RNA
前可能还要称重，这个过程肯定会出现融化。有时候，液氮碾磨过程中也会出现样品的融化；或者冷冻样品不经过液氮碾磨直接加入裂解液中，在彻底匀浆前肯定会出现融化。实验表明，冷冻组织在融化过程中比新鲜组织更容易发生
RNA 的降解。可能的原因是：冻融过程破坏了细胞内的结构，使内源酶更容易与 RNA 直接接触。
RNA 质量的判断
通常，使用电泳判断 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判断 RNA 的纯度。理论上，完整的 RNA 拥有 28S:18S =
2.7:1 的比例，大部分资料则强调 28S:18S = 2:1 的比例。事实是，除了细胞外，从其它样品中抽提的 RNA 几乎都得不到 2:1
的比例 (此结论使用 Agilent Bioanalyzer 获得)。RNA 的电泳结果受许多因素的影响，包括二级结构，电泳条件，上样量，被
EB 饱和的程度等。使用非变性电泳检测 RNA，以 DNA Marker 做对照，如果 2kb 处的 28S 和 0.9kb 处的 18S
条带清晰，且 28S:18S > 1，该完整性可以满足绝大部分后续实验要求了。A260/A280
是一个给大家带来许多困惑的指标。首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的 RNA，其 A260/280 = 2.0 左右。纯 RNA
是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’。现在大家却在拿 A260/A280 当‘因’用，认为“如果 A260/A280 = 2，所以
RNA 是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在您的 RNA 样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG 等，再测
A260/A280 比值。现实是，许多抽提 RNA 时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在 A260 和 A280 处附近有吸收，对
A260/A280 产生影响。目前最具有指导性的做法是：对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA
的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230 和 A260 是两个拐点，A300 接近 0，A260/A280 = 2.0 左右，A260/A230 =
2.0 左右。如果没有扫描数据，也一定要测定 A260/A230 比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。要考虑设备的线形范围
(A260 要处于 0.1 – 0.5 之间)。另外有两个有用的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM
EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。
RNAguard：抑制组织/细胞内源酶的试剂
综上所述，确保 RNA 不降解的传统做法是：在取组织前将含液氮的容器放在手边，一旦取出所需组织，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾钵中加入适量的液氮，再将组织从液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾钵中碾磨。碾磨过程中要及时补充液氮以防止组织融化。待组织彻底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好挥发完时，立即将碾磨碎的组织移入裂解液中快速匀浆......安全的称重几乎不可能。这么严格的操作，是没有多少实验人员去认真执行的。
RNAguard 能快速抑制样品中的内源酶活性，确保动物组织/细胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一个月不降解，-20C 一年以上不降解。 RNAguard 适用的样品包括：动物组织，培养细胞，昆虫，及部分植物组织。经过 RNAguard 处理的样品可以用几乎所有常用的 RNA 方法/试剂抽提 RNA，所有的操作与用新鲜组织没有什么不同。
使用 RNAguard 的操作非常简单：在取组织前预先估计组织的重量，在一个容器中加入 5-10 倍体积的 RNAguard，放在手边。取出所需组织后，立即切割成厚度小于 0.5 厘米，放入含 RNAguard 的容器中即可。抽提前先用镊子将组织从 RNAguard 中取出，在室温进行切割和称重后，移入裂解液中快速匀浆。
如果您面临下面的情况之一，您一定会发现使用 RNAguard 的好处：
实验室没有液氮罐或者 –70C 冰箱保存样品
易降解样品的 RNA 抽提或者抽提 RNA 经常碰到降解问题
样品必须准确称重
大规模 RNA 的抽提
样品的采集 – 手术室，野外
