RNA抽提注意事项和经验指南-3
RNA 抽提的“三大纪律八项注意”
纪律一：杜绝外源酶的污染。
注意一：严格戴好口罩，手套。
注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。
纪律二：阻止内源酶的活性
注意四：选择合适的匀浆方法。
注意五：选择合适的裂解液。
注意六：控制好样品的起始量。
纪律三：明确自己的抽提目的
注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。
注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。
Rnase 污染的10大来源
1：手指头 – 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
2：枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。
3：水/缓冲液 – 一定要确保无 Rnase 污染。
4：实验台面 – 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。
5：内源 Rnase – 所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。
6：RNA 样品 – RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。
7：质粒抽提 – 质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。
8：RNA 保存 – 即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
9：阳离子 (Ca, Mg) – 在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。
10：后续实验所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。
RNase 和 DEPC 处理
1：高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。实验证明：37 C 与 RNA 反应，没有灭菌的 PBS，活性点为 100 pg/ml；灭菌后，活性点为 100 ng/ml。当然，灭菌后 Rnase 仍然不能认为没有残留。
2：DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底破坏了 DEPC。破坏后可以闻到一点气味。
3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。结果提示，0.1% DEPC 只对 MOPS 有效，而 1% DEPC 对三种试剂都有效。
4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A 的浓度分别为：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。
RNA 抽提的10大窍门
1：快速阻止 Rnase 活性 – 样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活 Rnase。
2：选择合适的抽提方法 – 高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。
3：预判质量要求 – Northern，cDNA 文库构建对完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay) 对完整性要求不是很高。RT-PCR 对纯度 (酶抑制物残留) 要求很高。
4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5：检查 RNA 的完整性 – 电泳检测，28S:18S =2:1 是完整的标志，1:1 对大部分实验也是可以接受的。
6：去除 DNA – 用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。
7：降低外源酶的污染 – 不能从外面又导入酶。
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及 DNA 污染。
9：彻底溶解 RNA，必要时可以 65C 加热 5 分钟。
10：合适的保存方法 – 短时间可以 –20C 保存，长期请保存于 –80C。
提高 RNA 得率
首先要意识到不同得样品其 RNA 含量差别很大。高丰度 (2-4ug/mg) 的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度 (0.05-2ug/mg) 的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度 (<0.05ug/mg) 的如膀胱，骨，脂肪。
1：裂解细胞使 RNA 释放出来 – RNA 如果不被释放出来，得率是会降低的。电动匀浆比其它匀浆方法效果更好，但也可能需要结合其它得方法，如液氮捣碎，酶消化 (Lysozyme/Lyticase)
2：抽提方法的优化。基于苯酚的方法的最大问题是分层不彻底和部分 RNA
的丢失(不能全部将上清取出)。分层不彻底是因为核酸和蛋白质含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低样品量解决。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。RNA
的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。
