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方案6 用水溶性金属复合体监控蛋白质-蛋白质相互作用

2019.3.28

实验材料	待测蛋白质样品
试剂、试剂盒	过硫酸铵 4 X 凝胶上样缓冲液甲醇 PdCl2 5 X 反应缓冲液 TMPyP 三氟乙酸 Tris-二吡啶钌
仪器、耗材	加热器光交联反应器 SepPak C18 容器分光光度计注射器滤膜
实验步骤	一、用 Pd（Ⅱ）金属化 TMPyP 1.将 1mg (1.2umol) 的 TMPyP 溶于 1.4 ml 水中，然后加入 0.34 mg(1.9umol) 的 PdCl2, 加热至 95°C 反应 2 h。实验提示：在金属化过程中，4 个 Q 带峰值 518nm、554nm、584nm 和 639nm，会变为 525nm 和 558nm 的两个峰，因此可以用可见分光光度计来监控金属化过程。 2.冷却样品，并用孔径为 45um 的注射过滤器过滤，加入 TFA 至终浓度为 1%。 3.将溶液注入用 1%TFA 平衡好的 SepPakC18 容器中，用 5 ml1% 的 TFA 冲洗容器。 4.用 0.5 ml 的甲醇，将 TMPyP-PcKII) 洗脱到一预先称重的小离心管中。 5.甲醇蒸发后，将 TMPyP-Pd(II) 溶于 1ml 水中，在 417nm 处 [e=158X10³L/(mol·cm)] 测出其浓度。该试剂可在冷冻避光条件下无限期保存。二、光交联蛋白质警告：在使用氙灯光交联装置时，须戴安全的有色眼镜以保护眼睛。 1.在 1.7 ml 的小离心管内准备总反应体积为 20W 的蛋白样品，其中含有蛋白质、1 X 反应缓冲液和 125umol/L 的 TMPyP-Pd(II)，避光反应。 2.在光裂解反应之前，加人 5ul 新鲜配制的过硫酸铵。确保样品管在样品支架上呈水平状态（即与光束平行）。 3.将 SLP 相机与光源间的挡板移开，控制快门的开启时间为0.5s，此处可以使用相机的自动计时器。在关上快门后，将相机与光源之间的挡板重新装上。 4.迅速加入 7 ul 4 X 上样缓冲液，以终止反应。 5.SDS-PAGE 电泳后，考马斯亮蓝染色或 Western 印迹，对反应产物进行分析。图 10.26 显示的是一个典型的交联反应实验结果。在这个实验中，用上述方法使 UvsY 发生交联反应。可以从第六列看到：只有在金属复合物和过硫酸铵均存在的情况下，闪烁曝光光裂解交联反应才得以发生。同时可以看到的是：在第三列上，在未加人过硫酸铵的情况下长期曝光，可发生氧分子介导的交联反应。展开