Co IP Protocol-2
Protocol
1 调制protein A sapharose
protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存
用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s
去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次
加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。
2.抗原的检出
以下操作全在冰面或4度进行
去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。
30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube
往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h
加protein A sapharose50ul,再混匀1h
5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。
加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。
3.注意点
A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。
B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)
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