One Step RT- PCR PreMix（染料法）使用说明
One Step RT- PCR PreMix（染料法）
使 用 说 明 书
【前言】
本产品提供了一个灵敏、高效、快速地扩增并检测 RNA 的完整系统。One Step RT- PCR preMix 包
含所有 RT-PCR 所需的、并经优化的 Reaction Buffer、RT 酶混合物等，使用者只需加入适量的引物和待检
样品，即可进行 One Step RT- PCR 检测。
本产品使用高效率 M-MLV 反转录酶和化学修饰的热启动 Taq DNA 聚合酶，高保真的染料，为
RT-PCR 反应提供了更高的产量及灵敏度、特异性。
【规格】
50 Reactions/Kit
【试剂盒组成】
A2010A0116s 50test
Master Mix 750μl 1 支
Enzyme Mix 500μl 1 支
A2010A0116L 100test
Master Mix 750μl 1 支*2
Enzyme Mix 500μl 1 支*2
【用户自备的试剂、器材】
1．引物
试验前应准备好用于检测目的基因的引物。引物应用HPLC或PAGE纯化。
2．实验用水
使用DEPC处理的PCR用纯水。
3．待检样品
总RNA，mRNA
4. RNasefree & DNasefree 的tip头，离心管,薄壁PCR管等
5. 各种规格的移液器
6．Realtime PCR仪
本产品适用于下列Realtime PCR仪：ABI PRISM ® 7700、ABI PRISM ® 7500、ABI PRISM ® 7300、ABI
PRISM ® 7000、MJ Opticon 、BIORAD iCycler 、Roch LightCycler TM 等Real time PCR仪上使用，具体
使用方法请参照相应仪器的说明书。
【反应液配制】
反应液组份 加量 (μl) 终浓度 备注
One Step RT - PCR Reaction Buffer 15
Enzyme Mix 10
上游引物 5 300nM 用户自备
下游引物 5 300nM 用户自备
待检样品 5-10 10pg~100ng 用户自备
DEPC H 2 O 5-0 用户自备
总体积 50
注：1 通常初次使用本试剂时，可用引物浓度 300nM 进行实验，根据实验结果具体情况，在 200～1000nM 范围内调整引
物浓度。
2 引物、待检样品的具体加量用户可以根据实际情况调整，同时增减 DEPC 水用量，保证总反应体积不变即可。
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【RT-PCR 扩增检测】
1 将反应管放入荧光 PCR 扩增仪进行扩增检测。
2 循环参数设定（请参照各类仪器的操作说明进行设置）
步骤 温度（℃） 时间 循环数（次）
1 逆转录反应 50 15-30 分钟 1
2 预变性 95 5 分钟 1
3 变性 95 10 秒
4 退火、延伸及检测荧光 60 45-60 秒
40-50
步骤 4 中 60℃时荧光检测，检测通道：FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
注：以上扩增条件为实例，用户应根据引物的 Tm 值及扩增片段的大小来确定适合的变性时间、退火温度，退火时间和
循环次数，黑体字部分必须保留。
【保存条件】
本产品原则上在-20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。如果在短期内需持续使用时，融解后可在4℃
保存，最长可保存1周。
【注意事项】
1.本产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。
2.为保证实验结果的准确性和可靠性，请特别注意以下事项：
2.1 使用已校准的移液器，选用进口一次性使用的 PCR 反应管、离心管、tip 头等进行样本处理及配液等操作，所有用具
应不含 DNA 酶和 RNA 酶。
2.2 引物设计过程中应尽可能避免发夹结构、二聚体等现象的发生， PCR目标片段最好小于200bp，尽可能在150bp以内。
2.3 实验样品尽可能新鲜，提取过程应严防 RNA 酶污染及操作不当导致的 RNA 降解。
2.4 使用本产品时建议对 RT-PCR 扩增条件、引物浓度和样品用量进行调整，选择最适当的引物浓度、样品浓度和 PCR 扩
增条件。
3.本产品使用前应在室温充分融解，并用漩涡震荡器充分混匀。
4.统一配液后分装以减少加样误差，每次实验应设置阴性对照。
5.禁止标记 PCR 反应管，避免外源性荧光信号干扰。
6.PCR 反应管中不能有气泡，否则会产生非特异的荧光信号。若有气泡，可先用手指将气泡弹破，然后再低速离心消除。
7.实时荧光 PCR 仪器连续进行实验时，最好间隔一小时以上再使用。
8.实时荧光 PCR 仪需经常校正和清洁载样板板孔。
9.若使用Roch LightCyclerTM 荧光PCR仪，应将毛细管放在专门套管中，以便分装反应体系和加入待检样品。前述操作
完毕应低速离心数秒再将毛细管垂直缓慢放入样品架，以免折断；若发生折断，应小心取出，用专用小毛刷擦拭干净后
方可进行扩增。
10.实验室应严格分区，避免 PCR 产物污染。
