细胞外囊泡中磷酸化蛋白质组学研究
蛋白磷酸化水平的变化可指针疾病的变化，但却鲜有磷酸化蛋白被开发成为疾病诊断标记物。细胞外囊泡是由膜封闭的微环境，不受外界蛋白酶和其他酶的影响。这使得细胞外囊泡在体液中高度稳定，为开发磷酸化蛋白应用于医学诊断提供了契机。
今天为大家介绍一篇细胞外囊泡中磷酸化蛋白相关的文章：
Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer
PNAS , doi: 10.1073/pnas.1618088114
本篇研究从微泡和外泌体中提取和鉴定到迄今为止数目最多的磷酸化蛋白，并对健康组和疾病组（乳腺癌）的磷酸化蛋白进行相对定量分析。筛选出了多个潜在的生物标记物，并从中挑选了几个靶点蛋白，用PRM的方法在健康组和疾病组中进行了后期验证。
【主要结果】
1. 迄今为止最多，没有之一
本实验中共鉴定到9643个磷酸化特征肽段，是迄今为止在人血样来源的细胞外囊泡中鉴定到数目最多的磷酸化肽段。实验流程示意图如下。
图1. 实验流程示意图（健康组n=6,疾病组n=18）
2. 微泡、外泌体大不同
平均1mL人血浆中可鉴定到7000条磷酸化特征肽段。在外泌体中鉴定到的磷酸化肽段，其中50%在微泡中也可被检测到。这些磷酸化蛋白主要参与细胞通讯、刺激响应和生物起源等生物学过程。微泡中酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸磷酸化所占比例分别为2.0%、14.1%、83.9%。而外泌体中酪氨酸磷酸化的比例则较高，为13.7%。与苏氨酸的磷酸化比例（16.1%）接近。这表明微泡和外泌体的生物起源有很大差异。如图2所示。
图2. 微泡和外泌体中磷酸化肽段及磷酸化蛋白的分布
3. 不关蛋白组表达量的事，磷酸化水平确实升高了！
健康组与患病组细胞外囊泡蛋白组表达近乎一致的情况下，蛋白磷酸化水平却表现出了显著差异。表明这种差异不是由蛋白表达量的变化引起的，而切实反映了病患组细胞外囊泡蛋白磷酸化的程度（图3）。
图3. 微泡和外泌体蛋白组与磷酸化蛋白组的交叠维恩图
4. PRM验证实验-完整而严谨
挑选了四种磷酸化蛋白RALGAPA2、PKG1、TJP2和NFX1用PRM方法，在13个癌症患者和7个健康样本中进行了验证。结果表明这四种蛋白在癌症患者中显著高表达。
【小编心得】
这是一篇采用Label-free相对定量及PRM靶向验证的方法，对乳腺癌患者细胞外囊泡进行磷酸化蛋白进行细致而完整的分析的一篇经典文献。不仅建立了细胞外囊泡磷酸化蛋白组研究的方法，实验中筛选到的磷酸化蛋白可望应用于癌症的诊断和筛查中，为诊断医学起到巨大的推动作用。
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综述
