抗生素效价生物测定实验——管碟法
| 实验方法原理 | 管碟法是扩散法中的一种，是将已知浓度的标准抗生素溶液与未知浓度的样品溶液分别加到一种标准的不锈钢小管（即牛津小杯）中，在含有敏感试验菌的琼脂表面进行扩散渗透。比较两者对被试菌的抑制作用，测量出抑菌圈的大小，以计算抗生素的浓度。在一定的浓度范围内，抗生素的浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数关系，从样品的抑菌圈直径可在标准曲线上求得其效价。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | 培养基 I（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）培养基 II（培养基 I 加 0.5% 葡萄糖）培养板牛津杯／标准不锈钢小管陶瓦圆盖 |
| 实验步骤 | 1. 0.2 mol/L 的 pH6.0 磷酸缓冲液的配制 准确称取 KH2PO4 0.8 g 和 K2HPO4 0.2 g，置 100 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。 2. 标准青霉素溶液的配制 精确称取 15-20 mg 氨苄青霉素标准品，每毫克含 1667 单位（1 667 U/mg, 1 U 即 1 国际单位，等于 0.6 μg），溶解在适量的 0.2 mol/L 的 pH 6.0 磷酸缓冲液中，然后稀释成 10 U/ml 的青霉素标准溶液，按表 IX-2 配制成不同浓度的青霉素溶液，保存于 5℃ 备用。 3. 青霉素发酵液样品溶液的制备 用 0.2 mol/L 的 pH 6.0 磷酸缓冲液将青霉素发酵液适当稀释，备用。 4. 金黄色葡萄球菌菌液的制备 取用培养基 I 斜面保存的金黄色葡萄球菌菌种，将其接种于培养基 II 斜面试管上，于 37℃ 培养 18~20 h，连续传种 3~4 次，用 0.85% 的生理盐水洗下，离心后，菌体用生理盐水洗涤 1~2 次，再将其稀释至一定浓度（约 109 / ml, 或用光电比色计测定，在波长 650 nm 处；透光率为 20% 左右即可）。 5. 抗生素扩散平板的制备 取灭菌过的平皿 18 个。分别加入已融化的培养基 I 20 ml，摇匀，水平位置使其凝固，作为底层。另取培养基 II 融化后冷却至 48~50 ℃，加入适量上述金黄色葡萄球菌菌液，迅速摇匀，在每个平板内分别加入此含菌培养基 5 ml，使其在底层上均匀分布，置水平位置凝固后，在每个双层平板中以等距离均匀放置牛津杯 6 个，用陶瓦圆盖覆盖备用。 6. 标准曲线的制备 取上述制备的扩散平板 18 个，在每个平板上的 6 个牛津杯间隔的 3 个中各加入 1 U/ml 的标准品溶液，将每 3 个平板组成一组，共分 6 组。 在第一组的每个平板的3个空牛津杯中均加入 0.4 U/ml 的标准液，如此依次将 6 种不同浓度的标准液分别加入 6 组平板中（如图 IX-6），每一稀释度应更换一只吸管，每只牛津杯中的加入置为 0.2 ml 或用带滴头的滴管加样品，加样量与杯口水平为准，全部盖上陶瓦盖后 37 ℃ 培养 16~18 h。 精确测量各抑菌圈的直径，分别求得每组 3 个平板中 1 U/ml 标准品抑菌圈直径与其他各浓度标准品抑菌圈直径的平均值，再求出 6 组中 10 U/ml 标准品抑菌圈直径的平均值，总平均值与每组 10 U/ml 标准品抑菌圈直径平均值的差，即为各组的校正值。 例如，如果 6 组 1 U/ml 标准品抑菌圈直径总平均值为 22.6 mm，而 0.4 U/ml 的一组中 9 个 1 U/ml 标准品抑菌圈直径平均为 22.4 mm，则其校正数应为 22.6-22.4=0.2，如果 9 个 0.4 U/ml 标准品抑菌圈直径平均为 18.6 mm 则校正后应为 18.6+0.2=18.8 mm。以浓度为纵坐标，以校正后的抑菌圈直径为横坐标，在双周半对数图纸上绘制标准曲线。 7.青霉素发酵液效价测定 取扩散平板 3 个，在每个平板上的 6 个牛津杯间隔的 3 个中各加入 1 U/ml 的标准品溶液，其他 3 杯中各加入适当稀释的样品发酵液，盖上陶瓦盖后培养 16~18 h。 精确测量每个抑菌圈的直径，分别求出标准品溶液和样品溶液所致的 9 个抑菌圈直径的平均值，按照上述标准曲线的制备方法求得校正数后，将样品溶液的抑菌圈直径的平均值校正，再从标准曲线中査出标准品溶液的效价，并换算成每毫升样品所含的单位数。 展开 |
| 注意事项 | 注意控制金黄色葡萄球菌菌液的浓度，以免其影响抑菌圈的大小。一般情况下， 100 ml 培养基 II 中加 3~4 ml 菌液（109/ ml）较好。 |
