含乳饮料中山梨酸·苯甲酸·糖精钠的含量测定前处理...
添加到食品和饮料中的防腐剂是防止或阻断引起食品腐败的微生物生长的一类物质。山梨酸(Sorbic acid，sA)，苯甲酸(Benzoic acid，SB)，常作为防腐剂，糖精钠(Sodium saccha-tin，Sac)作为甜味剂广泛用于食品中。但添加过量防腐剂，不仅能破坏维生素 B还能使钙形成不溶性物质，影响人体对钙的吸收，同时对人的胃肠有刺激作用。过量食用还可引发癌症⋯1。因此国家对其使用都有明确的限量标准和检测方法[2-3]。国家标准中只规定了汽水、果汁类、酒类饮料品中sA，SB，Sac的测定方法，用氨水将样品调至中性，过滤后直接用于 HPLC测定，其处理方法不适用于蛋白质含量高的奶制品和乳制品。含乳饮料中除含大量蛋白质外，还有稳定剂，增稠剂等，用HPLC法测定这类样品中的 sA，SB，Sac，样品前处理是一重要及难度较大的问题，因此寻求适宜，通用，简便的前处理方法是许多技术人员多年来致力的目标。常用的方法有：①用乙醚一石油醚液液萃取_4 ；②用乙醚提取，再用碳酸氢钠溶液反提_5 ；③乙酸锌一亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白质_1 ；④将样品用 1：1氨水调 pn=7，再用乙醇沉淀蛋白质[ ；⑤先用 NaOH溶液处理样品，再用 20％硫酸铜沉淀蛋白质_7j。笔者用几种方法分别处理含乳饮料，对处理效果及HPLC测定条件进行研究。
l 材料与方法
1．1 仪器与试剂 Waters高效液相色谱仪：配置 510泵，717自动进样器，996二极管阵列检测器(PDA)，Millenium 32色谱工作站。山梨酸(sA)；苯甲酸(sB)；糖精钠(Sac)均为 Sigma公司产品，甲醇：色谱纯，其余试剂均为分析纯。
1．2 标准溶液的配制
1．2．1 标准溶液储备液。分别准确称取 sA、SB、Sac标样各10 mg左右(准确至 0．01)，SA、SB用碳酸氢钠(20 L)溶解；Sac用水溶解，用水定容至25．0o 。作为标准溶液储备液0
1．2．2 标准溶液使用液。分别取各标准储备液适量，用水配制成标准混合溶液，浓度分别为 sA、sB 15 ／ 左右，Sac25 左右。
1．3 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna Cl8柱5 tan，4．6 r
ain×250nan；检测波长：230 nm；流动相；MeOH：0．02 mol／LNH4Ac
=15：85( )；流速 1．0 ml／min。将 1．2所配标样混合液进样5 ，色谱见图 1。毫
2：00 4：00 6：00 8：00 1 0：00 12：00 14：O0 16：00时间IVmin
注 ：1为 sB，2为 Sac，3为 SAo Fl司。图1 山梨酸、苯甲酸、糖精钠标样 LC色谱图1．4 样品的前处理 称取样品5 g左右(精确至 ±0．O1)于50 比色管中，加入纯水 20 ，摇匀，加入亚铁氰化钾(150L)溶液5 ，摇匀，放置5 min，加入硫酸锌(30o L)溶液 5，混匀，纯水定容至 5o ，振荡使其充分混匀，静置 15 min，上清液过滤，弃去初滤液，滤液经 0．45肿 滤膜过滤，供 HPLC检测。
2 结果与分析
2．1 蛋白质沉淀剂的选择 以含山梨酸、苯甲酸浓度为0．050 g／ks；糖精钠的浓度为0．100 g／ks的模拟乳饮料作为样品1分别使用无水乙醇；5％硫酸铜；20％硫酸铜一NaOH氢氧化钠；10％钨酸钠；5％高氯酸；亚铁氰化钾(150 g／L)与硫酸锌(30o L)溶液为沉淀剂来沉淀蛋白质。由表 1可知，用亚铁氰化钾(150 L)与硫酸锌(30o L)溶液来沉淀蛋白质时间短，蛋白质沉淀完全，沉淀后的溶液用定量滤纸过滤，滤液清澈透明，可直接进样测定，模拟样品 I。
2．2 最佳色谱条件的确定 甲醇与乙酸铵溶液的不同比例对色谱分离的影响。山梨酸、苯甲酸、糖精钠在液相色谱的出峰次序很有特点，试验表明，在流动相中甲醇：乙酸铵溶液(0．02 mot／L)为15：85时，出峰的次序是苯甲酸、糖精钠、山梨酸；当甲醇：乙酸铵溶液(0．2 mot／L)为5：95时，出峰的次序是苯甲酸、山梨酸、糖精钠；甲醇：乙酸铵溶液(0．02 mot／L)为25：75时，出峰的次序是糖精钠、苯甲酸、山梨酸。不同色谱条件下分离效果见图3，因此，当流动相中甲醇：乙酸铵溶液(0．02 mot／L)为15：85时，分离最好，保留时间合适。时间IVm_m时间 m_m0000时间 ffm_m
注：a为 15：85，b为5：95，c为 25；75。
2．3 标准曲线及回归方程 在试验色谱条件下，将所配的标准溶液使用液依次进样 1,2、3、5、10、15 ，以山梨酸、苯甲酸、糖精钠混合标样进样量 ( )与峰面积 Y作线性回归。
专≈善进样量 “g回归方程分别为 SB：Y=3．36×lO6 一2．11×lO4，r=0．999 98；Sac：Y=1．88×10％一2．09×lO4，r=0．9994：SA：Y=7．09×10％一2．25×lO4，r：0．999 8。在试验色谱条件下，山梨酸、苯甲酸、糖精钠浓度与其色谱峰峰面积有着很好的线性关系，线性范围山梨酸、苯甲酸为 15～320 ng，糖精钠为25～534 ng。2．4 精密度的测定 按试验选定的色谱条件，对 3种市售乳饮料样品进行含量测定，考察方法的精密度，结果见表 2。表 2 样品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠及精密度测定(Jl=5)
2．5 加标回收率测定 按试验选定的色谱条件，用 AD钙奶
进行加标回收率测定，考察方法的准确性，测定结果见表 3。加标回收率结果(Jl=5)
2．6 方法检出限 在试验条件下，当试样称样量为2．00 g，
定容到50 rnl，进样量为20 ，山梨酸、苯甲酸、糖精钠检出限为0．1 mg／kg，结果的相对标准偏差小于2．5％。
3 结论
试验测定含乳饮料中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的含量，在比较了 6种蛋白质沉淀剂的基础上选用亚铁氰化钾(150g／L)与硫酸锌(30o g／L)沉淀溶液样品中的蛋白质，使蛋白质沉淀完全，滤液清澈透明，排除了大部分干扰物质的影响，运用二极管阵列检测器，能进行光谱分析及峰纯度检测，弥补了单靠保留时间定性的局限，保证了检测结果的正确、可靠。该方法快速、灵敏、精密度及准确度在允许范围内，可用于乳饮料中以上 3种成分的含量测定。
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