聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定IgG纯度（二）
（三）操作方法
1．安装夹心式垂直板电泳槽
夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由一个上框形凝胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。电泳槽由上储槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下储槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠储液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装：
（1）将上储槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。
（2）将上、短玻璃板分别插到上框形硅橡胶的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
（3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上储槽上，短玻璃板应面对上储槽。
（4）将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽 ，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽 。
（5）竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。
2．配胶
① 分离胶 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝胶缓冲液（pH8.9）2.5ml，分离胶贮液5.0ml，重蒸馏水2.5ml，充分混匀，抽气10min，后加AP 10 ml。
② 浓缩胶 pH6.7 25% PAA：浓缩胶缓冲液∶浓缩胶贮液∶40%蔗糖溶液∶核黄素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。
3．制备凝胶板
不连续体系采用不同孔径及pH的分离胶与浓缩胶 ，凝胶制备应分2步进行。
① 分离胶的制备：根据实验要求，选择终丙烯酰胺的浓度，本实验需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加胶方式不同于连续系统。混合后的凝胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1cm注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水（约3-4mm）用于隔绝空气，使胶面平整。为防止渗漏，在上、下储槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。用滤纸条吸去多余的水，但不要碰破胶面。如需预电泳，则上、下储槽的蒸馏水倒去，换上分离胶缓冲液，10mA电流电泳1h，终止电泳后，弃去分离胶缓冲液，用注射器取浓缩胶缓冲液洗涤胶面数次，即可制备浓缩胶。
② 浓缩胶制备：浓缩胶为pH6.7 25% PAA，混合均匀后用细长的滴管将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内（即分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。在上、下储槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。在距离电极槽10cm处，用日光灯或太阳照射，进行光聚合，但不要造成大的生温。在正常情况下，照射6-7min，则凝胶由蛋黄透明变成乳白色，表明聚合作用开始。继续光照30min，使凝胶聚合完全。光聚和完成后放置30-60min，轻轻取出样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体，加入稀释10倍pH8.3的Tris-甘氨酸电极缓冲液。使液面没过玻璃板约0.5cm，即可加样。
4．加样
作为分析用的PAGE加样量仅需几微克，2-3ul血清电泳后就能分出几十条蛋白区带。为防止样品扩散，应在样品中加入等体积40%蔗糖（内含少许溴酚兰）。用微量注射器取5ul上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
5．电泳
将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接（方向切勿接错）。接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10 mA 。待样品进入分离胶时将电流调至20-30mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘1cm时，将电流调回到零，关电源及冷却水。分别收集上、下贮槽电极缓冲液置试剂瓶中，4℃贮存还可用1-2次。旋松固定螺丝，取出硅橡胶框，用不锈钢铲轻轻将一块玻璃板撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
6．固定，染色
本实验采用0.05%考马斯亮蓝R250（内含20%磺基水杨酸）染色液，染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min左右。
7．脱色
用7%乙酸侵泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或褪色摇床，则可缩短褪色时间。脱色液经活性碳脱色后，可反复使用。
