关于CRISPRCAS9介导的基因编辑细胞株的一些经验总结
最近小编在应用CRISPR/CAS9作为工具制备基因编辑细胞株，有一些阶段性总结和设想，在这里贴出来，大家可以互相探讨一下。
首先要描述一下“基因编辑细胞株”的具体要求：
（1）“基因编辑”是指在特定位点引入期望的碱基修饰。
具体过程为，通过CRISPR/CAS9在待编辑位点（靶位点）附近引入基因组DNA双链断裂（DSB）后，通过同源重组介导的修复（Homology Directed Repair，HDR）引入期望的序列改变。
（2）无痕编辑。
即在得到的基因编辑细胞株中，除待编辑位点外，细胞株基因组不发生变化。
（3）纯合子。
即对于得到的细胞株中，所有单个细胞对于所包含的几套染色体（对于肿瘤细胞，多数情况为异倍体），靶位点均发生特定碱基修饰。
目前为止小编只想到3条（其实这3条就足以让人眉头紧蹙了），欢迎在留言区补充！
下面，小编分几个方面罗列目前的一些总结或设想，权作抛砖引玉，继续欢迎大家在留言区轻拍讨论。
第一方面：同源模板
1）不采用ssODN（single-stranded donor oligonucleotides）。
有一原则，即要引入的突变序列越长，需要的同源臂越长。
原本ssODN对于点突变等小范围修改是非常便利，但小编还是准备忍痛割爱。
因为效率低（得到突变纯合子的平均中位值约2%），且ssODN难以引入筛选标签，只能通过PCR的方法盲筛。对于转染效率低的细胞，采用ssODN往往事倍功半。
2）使用Donor质粒，且需要有阳性和阴性筛选Marker
● Donor质粒结构如下：
阳性筛选Marker：加药后，含有此基因的细胞存活。
阴性筛选Marker：加药后，含有此基因的细胞凋亡。
● CAS9切割基因组产生DSB后，Donor质粒介导基因组的插入：
此时加入阳性筛选药物，去除未发生HDR的细胞。
●之后转染表达转座酶的质粒，图中绿色PB及中间序列被无痕切除，修饰完成：
此时加入阴性筛选药物，去除无痕切除不成功的细胞。
在此基础上，再通过PCR的方法筛选纯合子，效率可以提高至25%左右。
3）适当延长donor质粒左右臂长度
突变片段越大，需要的左右臂长度越大，一般在600到2000之间。
4）防止CAS9二次切割
在donor质粒上，需要将对应sgRNA的PAM或邻近PAM的序列进行同义突变，以防止donor质粒插入基因组前后被CAS9识别并切割。
5）扩增左右臂的模板选择要慎重
左右臂需要以待突变的目的细胞基因组为模板扩增，避免不同细胞基因组差异导致左右臂不同源，降低HDR效率。
6）质粒构建难度大
构建donor质粒需要线性化质粒、左臂、插入片段、右臂4段片段连接，建议采用Gibson法。
7）质粒质量要求高
质粒纯化后浓度需要高于1ug/ul。
第二方面：CRISPR/CAS9切割
1）避免脱靶
sgRNA设计避免脱靶。
采用nick形式的CAS9加双sgRNA，实际切割效率不低，且避免脱靶。
2）sgRNA贴近编辑位点
CAS9切割位置在待修饰位点的30bp以内，最差保持在50bp以内。
3）保证sgRNA活性
sgRNA活性是影响KI的关键因素之一，因此需要提前验证其活性。
4）CAS9形式选择
缩短CAS9蛋白在细胞内的存续时间，可以避免连续切割和脱靶，建议使用mRNA或蛋白形式的CAS9。若采用质粒，需要确保其纯度和浓度（建议大于1μg/μl）。
第三方面：对细胞的要求
1）细胞需保真
制备一株基因编辑细胞株所需要的时间、人力和金钱成本都是较高的，前提是细胞必须STR验证通过。
2）提前确定靶位点序列
所有操作前，对待修饰的细胞需要提前测序了解靶位点的序列。
3）预实验确定细胞特性
需要提前确定细胞最优转染方式、单克隆形成能力及筛选药物的最适浓度。
此文写罢，才疏学浅，心下惴惴，盼在留言区见各位高论！
文献参考
1. PMID: 27709569.CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.
2. PMID: 26748756. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions.
3. PMID: 27532820. Comprehensive Protocols for CRISPR/Cas9-based Gene Editing in Human Pluripotent Stem Cells.
4. PMID: 22189101Concerted nicking of donor and chromosomal acceptor DNA promotes homology-directed gene targeting in human cells.
