老年性痴呆的动物模型及评价（四）
2．APP和PS转基因小鼠
（1）Aβ沉积
早期发病的AD在整个AD病人中所占的比例较少，主要发生于30-60岁，通常带有家族性。FAD中已发现了3个基因的突变能导致AD，即APP、PS1 和PS2基因。而转基因小鼠过度表达FAD的APP、PS1和PS2等位基因能提高大脑Aβ水平。4种表达FAD突变型APP等位基因的转基因鼠系已建 立，能产生SP，其具有双折射特性及年龄依赖的特点[25，26，30，40 ]。第一个增加小鼠大脑Aβ水平的报道来自于转人类APP695swe[24]和APP717V-F突变的PDAPP鼠。其APP水平为鼠内源APP的 2~3倍，有Aβ沉积的形成 [25]。用YAC技术和表达3倍于鼠APP水平的人类APPswe(R1.40)小鼠也显示出总Aβ产量的提高和成比例增加的Aβ42（约占总量的 20%）[41]，与先前体外转染APPswe细胞系的结果相似[42]。对PDAPP鼠进一步的分析[25]表明APP和APPs-β的区域水平在所有 年龄都是常量，而大脑一些区域中Aβ水平相对其它区域高，这些区域Aβ的沉积随年龄增加而积累。与预期的结果相一致，APPV717I突变的PDAPP小 鼠产生的Aβ42为Aβ的主要种类[43]，而在含有APPV717I突变的AD病人皮质也有相似的结果报道[44]。国内目前也有此类转基因动物模型， 秦川[45]等制作的过度表达APP695、751小鼠，与对照组相比，Aβ42免疫组化显示大脑皮层、小鼠及海马的神经细胞有Aβ沉积形成，刚果红染色 可见大脑皮层及皮层间有淀粉样物质形成。
对杂合子和纯合子PDAPP小鼠几个不同大脑区域APP水平的比较分析表明，纯合子小鼠丘脑中全长APP的水平比杂合子鼠海马中的要高。即使转入的APP 基因是持续过度表达的，皮质和海马中由单位全长APP产生的Aβ的水平是最高的。Aβ的沉积发生在这些区域，却没有发生在丘脑 [43]，表明转基因小鼠大脑区域性因素使APP代谢产生Aβ和淀粉样斑在这些区域的形成变得容易。与AD病人相似，小脑的病理损害是最轻的，直到疾病晚 期才开始发生。一个值得注意的例外是PS1E246A突变小鼠，其小脑病理改变在疾病相对早期的阶段就能观察到[46]。
过度表达PS1M146L或M146V基因小鼠大脑中的Aβ42的水平大约比表达PS1野生型（PS1WT）小鼠的Aβ42要高30%，而Aβ40水平却 没有显著性差异。这些数据与含有PS1突变的FAD中观察到的Aβ42水平增加的结果相吻合。转PS2突变基因的小鼠大脑Aβ42水平也比转PS2野生型 （PS2WT）的小鼠更高。然而，即使在研究中使用相同的夹心ELISA分析方法，在Oyama等研究中，转PS2基因小鼠的Aβ水平并不与Duff等描 述的PS1转基因小鼠相一致[47]。另一个不一致是在非转基因的小鼠其Aβ的水平比PS2转基因小鼠的更高一些[48] ，而过度表达突变型PS小鼠的大脑中并没有出现任何的Aβ沉积，至少是在12月龄的时候。在转PS1和PS2突变型基因小鼠中没有出现关于Aβ沉积的报 道，这可能归因于在这些小鼠中产生的Aβ或小鼠Aβ与人类Aβ在第3氨基酸残基不同。有报道啮齿类动物Aβ在体外不象人类Aβ那样具有淀粉源性，并且转基 因小鼠过多的制造鼠源Aβ显示出与人类Aβ有共同免疫反应而当成弥散性沉积[49] 。
为检测突变型PS1基因对转基因鼠中人类APP代谢的影响，几个研究小组建立双转基因小鼠。同时表达FAD PS1和APP基因的小鼠小鼠显示出加速的淀粉样沉积[50]。转APPswe小鼠[24]和PS1M146L小鼠[47]杂交后产生的后代在13到16 周时，其皮质产生硫磺素S阳性Aβ沉积[43]。相似的，转APPswe小鼠和PS1A246E小鼠杂交后产生加速的Aβ沉积，能在9个月龄时就能检测到 [51]。PS1FAD的突变能够增加Aβ42的产量[52] ，这些小鼠中加速的沉积的弥散斑主要是由Aβ42构成的，与这些斑为AD和Down’s综合症SP前身的假说相一致。另外观察到转Thy1-APPswe 小鼠——APP23，在弥散斑存在时就产生了具有刚果红折光性的斑，这表明在小鼠身上从弥散斑到致密斑的成熟可能不是致密斑形成的先决条件[26]。这些 体内实验结果证实突变型PS1能影响APP的代谢过程，与体外转基因细胞试验相一致。这些研究同样也表明转突变型PS和 APP杂交鼠提供了小鼠脑内形成Aβ沉积的最快途径。
为考察减少的PS1WT对小鼠Aβ42/43水平的影响，PS1敲除小鼠与转APPswe小鼠进行交配。1月和5月的后代大脑中的Aβ水平与PS1WT小 鼠相比没有显著性差异。这表明FAD相联的PS1突变导致疾病的机制不能归因于衰老过程中PS1WT的减少[53]。在另一个独立研究中发现PS1无效基 因小鼠的Aβ40和Aβ42水平减少，表明AD病人中Aβ42的增加不是由于PS1的突变使PS1功能的丧失而引起的。在PS1敲除的无效背景中导入 Thy1-PS1A246E基因的小鼠同样也进行了Aβ的测量，与Thy1-PS1 WT转基因或非转基因的对照相比，其Aβ42/ Aβ43的水平增加了[21]。
（2）Tau的改变
采用银染的方法对转APP和PS基因小鼠已存在的神经纤维进行分析，在过度表达PS1和APP的FAD等位基因小鼠中，没有检测到NFT。然而，在一些鼠 系出现了NFT的早期改变——tau的高度磷酸化。在Thy1-APPswe小鼠中，采用tau抗体对几个磷酸化表位进行确认，发现扭曲的轴突含有高度磷 酸化tau[26]。NSE-APP751小鼠也有报道显示出Alz50染色阳性[54]。
（3）营养障碍轴突、神经元损失和反应性胶质增生
在PrP-APPswe小鼠[24]中，用Gallyas银染的方法发现斑的邻近区域存在营养障碍轴突。PDAPP小鼠中使用抗突触素的抗体观察到的扭曲轴突与AD病人中的轴突改变相似，其营养障碍轴突具有密集的板状体和神经丝的聚集，具有AD Ι型营养障碍轴突特
突触的损失和神经元的死亡是AD的典型特征。神经元的损失可发生在SP附近区域，这已在PDAPP717[25]和Thy1-APPswe[26]小鼠中 报道过。然而对18月龄PDAPP小鼠的立体测量学研究表明，其皮质，海马或扣状带等有斑的区域没有显示出明显的神经元损失；而突触素、MAP-2、细胞 色素氧化酶-2和细胞色素氧化酶-4的水平没有减少，而胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）水平却明显增加[55]。与之相似，9月和12月的PS1A246E转基因小鼠其皮质和海马的神经元的数量没有明显的减少 [51]。用相同的研究方法发现14到18月龄的APP23（Thy1-APPswe）转基因小鼠，其CA1区的金字塔神经元有明显的减少 （14-25%），与此区域斑的数量呈负相关。其新皮质区域神经元计数与斑的数量之间却没有相关性。将同样的技术应用于AD病人大脑中得到了一个相似的结 论[56]。APP23小鼠和其它APP转基因小鼠之间的区别是APP23有一个更高的致密斑数量（占到90%）。至今没有报道表明PS1和APP双转基因小鼠中出现有神经元损失的病理改变。
反应性胶质增生已在一些小鼠模型中报道。在PrP-APP695swe小鼠 [24]、PDAPP小鼠[55]和YAC过度表达APPsweR1.40系转基因小鼠（Lamb et al.NSc.1998）中报道过GFAP染色阳性的星形胶质细胞增生，用细胞形态学方法检测到小胶质细胞增生以及轴突的异常改变。但仅是在那些含有很高 刚果红折光性斑的小鼠中才检测到炎性反应[26]。反应性胶质细胞增生并没有在9月或12月龄的HuPS1A246E小鼠检测到，推测是由于Aβ沉积缺乏 所致。在PS1-A246E/APPswe和PS1 M146L/APPswe双转基因小鼠中，使用抗GFAP的抗体能检测到反应性星形胶质细胞包围着Aβ沉积[51]。因此，反应性胶质增生似乎与Aβ沉积相联。
（4）记忆力障碍
在小鼠的行为学研究中，Morris 水迷宫经常被用来检测空间参考记忆；Y迷宫去检测空间近期记忆；而放射状迷宫用来检测空间工作记忆。采用这些测试方法，在APP转基因小鼠上发现学习和记 忆障碍。Tg2576小鼠在10月龄时，与对照的非转基因小鼠相比，在Y迷宫和Morris水迷宫显示出明显成绩下降。Tg2576小鼠回交到S
从Tg2576与APPswe杂交获得的双转基因小鼠[57]在3-3.5月龄时，在Y迷宫测试中成绩明显下降。这个双转基因的小鼠中发生的行为学障碍并 不比Tg2576 和APPswe小鼠发生得更早。Tg2576双亲鼠系3月龄的更早期分析表明，Y形迷宫测试中几乎有确定的数值改变，但数据却没有统计学差异，这可能是由 于研究的老鼠数量偏少的原因[24]。这表明Tg2576小鼠在Y迷宫的出现的行为学改变既不是年龄依赖性的，也不因PS1M146L基因突变的存在而加 速。NSE-APP751小鼠同样在水迷宫测试中表现出空间学习障碍。其行为学障碍在6-12月龄时变得明显起来[58]。这表明认知的损害是由于APP 的过度表达引起的，而此时还没有淀粉样沉积的出现。与此相似，PrP-APPswe鼠回交到C57B6/L背景中制造出的小鼠用Morris水迷宫检测， 其行为学障碍发生于12月龄，与对照组相比具有更长的逃避潜伏期[59]，而这些行为学障碍的小鼠却缺乏Aβ沉积。这些小鼠产生最早的Aβ沉积部位是在齿 状回分子层外部，与AD病人大脑SP经常发生在齿状回分子层外部相似。综上所述，转基因小鼠在Morris水迷宫和Y迷宫所表现出认知功能的下降开始于任 何分子层侦测到淀粉样沉积以前。需要进一步确定的是，淀粉样沉积是否进一步加重了小鼠在Y-迷宫中的行为学损害。
3. Aβ和C100-4转基因小鼠
转基因小鼠也通过使用Aβ，100或104个氨基酸的APP片段来产生。C100是β分泌酶剪切APP的产物，能够被γ分泌酶所水解而产生C端的Aβ。 FVB/N转基因小鼠过度产生Aβ42，表现在整个皮质、齿状回、丘脑和后脑的神经元都有Aβ的免疫反应[60]。和Hsiao APPswe FVB/N小鼠相似[52]，这些FVB/N小鼠表现出神经系统的异常和幼年的死亡，用TUNEL染色方法检测到神经细胞凋亡和神经细胞发生的变性 [60]。推测可能是过多的Aβ42直接引起了神经元的变性和凋亡，导致这些小鼠身上所观察到的神经学上的异常，但也可能是FVB/N遗传背景产生的特殊 表现[32]。
三个研究小组产生了过度表达APP片段C100（或C104）的转基因小鼠[61，62，63]。APP的C100区域含有APP的跨膜区域和α、β、γ 分泌酶的酶切位点。有一个是与信号肽设计在一起，以确保C100片段进入细胞的膜内室，在那里与分泌酶发生作用。C100的表达在启动子的控制下制造出年 龄依赖的神经变性和海马齿状回区域的突触损失。表达C104的B6C3鼠使用的是神经丝轻链启动子，大脑结构中检测到年龄依赖的Aβ聚集的免疫反应。然 而，在免疫杂交和免疫沉淀中却没有检测到4kD的Aβ蛋白。这些小鼠海马CA1区表现出年龄依赖星形胶质、小胶质增生反应和神经元损失。其在Morris 水迷宫中出现了空间学习障碍以及减少的长时程增强（LTP），而长时程抑制（LTD）却没有变化[62]。以上结果中产生出这样的问题，究竟APP哪一方 面的代谢产生神经变性和认知障碍？一些转基因小鼠发展成行为学障碍而没有Aβ沉积的形成，这表明神经元功能障碍起源于APP的水解及运输与Aβ的产量有关 联，但却不依赖于Aβ的产量。相反，在含有一个信号肽转基因的C100小鼠，Aβ的产量能在C57BL/6×DBA鼠中检测到[63]。该鼠到9月龄时没 有产生明显的淀粉样沉积，也没AchE活性的下降。在这些小鼠中，Aβ的沉积是否呈现年龄依赖的模式将是一个值得深入研究的问题。
