老年性痴呆的动物模型及评价（六）
五、多重复制AD模型
多重复制AD模型，是在现有模型的基础上，利用综合两种或两种以上模型方法获得的一种复合模型。这类模型可以综合获得各种已有模型特点，符合AD的多因素 发病机制。目前已有的动物模型有，将Aβ(1～40或25～35)和小剂量的IBO共同注入大鼠海马，2周后除出现神经元大量丢失外，注射点附近以及包括 CA1、CA2和部分脑回在内的脑区出现多数神经元异常。本实验室采用D-半乳糖和AlCl3合并制备的AD模型呈现了整体衰老、学习记忆功能下降、胆碱 能系统功能减退、脑组织β-APP、PS1、BACE基因表达明显增强，脑组织出现Aβ沉积并有类SP形成，成功地模拟了AD的发病及病理特征[82]。 在未发表的结果中，通过经典的Bieshowky银染的方法证实海马和大脑皮质神经纤维数量较正常对照组明显减少，排列紊乱和NFT形成。该方法造模简 单，造价低廉，适合大规模药物筛选。就现有的AD动物模型而言，由于没有一个完全模拟AD特征的动物模型，单一模型只模拟AD部分病理改变，把各种制作单 一模型的方法加以组合来模拟AD复杂的病因，是制备AD模型一个比较实际而有效的方法。
六、其它模拟AD部分特征的动物模型
冈田酸(okadaic acid，OA)损害模型：OA可以选择性抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶1A和2A，引起大鼠脑内出现类似AD病理改变的双螺旋丝(paired helical filament，PHF)样的磷酸化tau蛋白和Aβ沉积[83]。
脑缺血痴呆动物模型：人脑的供氧系统对脑功能有着重要的保护作用，缺血缺氧首先影响的是脑的正常功能，此时极易出现智能障碍。通常老年动物脑血流量较成年动物减少20%以上，老年动物慢性脑缺血，可以产生类似AD的病理生理改变[84]。
β淀粉样肽(Aβ)损害模型：Aβ具有神经营养和神经毒性双重作用[85]。根据Hardy和Higgins 1992年在《Science》上提出的AD Aβ级联反应假说，Aβ沉积导致SP、NTF形成、细胞死亡和血管病变，最终导致痴呆。
第三节 小结和展望
目前AD实验动物模型的滞后在很大程度上制约了其治疗药物的筛选，还没有一个理想的AD治疗药物筛选模型。随着AD病因和发病机制知识的增加和更加完善的 AD动物模型的出现，我们将能够筛选得到具有良好开发前景的AD治疗药物，使这些药物经临床前客观评价后顺利进入临床试验。已有的AD动物模型，总的来 说，包括非转基因模型和转基因模型两大类。非转基因模型中，大部分AD模型只针对疾病某一方面的因素来制作AD模型，种类比较多，表现有空间学习记忆功能 的衰退，大多只针对AD病理的某一方面，相比AD错综复杂的病理过程来说有一定的差距。更重要的是缺乏AD脑内特征性变化，即AD病理改变中的SP和 NFT。非转基因模型的优点是其制备方法相对简单，重复性和稳定性较好，适合大规模药物筛选，其中多重复制AD模型能多更好的模拟出AD的多病因的综合作 用，基本具备了AD的病理特征，将是一个较好的药物筛选模型。
最近出现的转基因动物模型是AD模型中的一个热点，在小鼠中构建AD致病基因的转基因动物在AD动物模型方面前进了一大步，转基因小鼠在遗传学上模拟了 AD的发病，出现了许多AD的病理学特征的改变，包括细胞外Aβ的沉积、SP和NFT等，部分转基因小鼠还出现了炎性反应的改变。在这些小鼠模型中，Aβ 的浓度和Aβ沉积的大小能进行定量分析并且这些指标能反应出淀粉样沉积的严重程度。大脑Aβ水平的免疫学分析能被用来监测化合物的效果，并能进一步分析其 作用机制，是干扰APP到Aβ的代谢还是阻止Aβ的变性。使用AD转基因小鼠模型可以用于新药发现的领域，单一转基因小鼠通过杂交能产生转多基因的小鼠， 这些小鼠与转单基因的小鼠相比能较早的发展成Aβ沉积，可以加速实验的进程。因此，转基因小鼠对于评价一些针对Aβ和/或SP的产生、清除及对抗炎性反应 的药物是有用的。AD的潜在候选药物，如抗炎药物和β、γ分泌酶抑制剂，而后者能抑制蛋白水解酶的活性而阻断淀粉斑的形成从而减缓AD的发病进程。目前国 外已有β、γ分泌酶抑制剂的报道，由于γ分泌酶抑制剂只影响到Aβ产生对其他蛋白的代谢影响小，所以被认为是理想的作用靶点。γ分泌酶抑制剂按其核心结构 可分为为五类，分别为肽醛（peptide aldehydes）类、双氟酮(difluoro ketones)类、甲基丙烯酸类似物（hydroxyethyl analogues）、氨磺酰葑胺（fenchy lamine sulfonamide）类和其他类。它们采用的大都是体外培养的转APP基因细胞分析系统来检测抑制剂对APP代谢的影响。本实验室采用体外培养的转染 有AD患者APP及突变型PS1基因的CHO细胞系（M146L），使之产生Aβ42，建立体外AD治疗药物筛选模型，通过筛选治疗老年痴呆常用复方中使 用频率较高的一些单味中药及广东习用药材中的已知单体，初步发现广东海风藤中的五味子乙素具有明显抑制Aβ42产生的作用。表明五味子乙素很可能是一种潜 在的β和（或）γ分泌酶抑制剂，有可能成为治疗AD很有前景的药物，拟用转基因动物模型和多重复制模型进行体内的药效试验。目前，分泌酶抑制剂这类药物大 都尚处在动物实验室阶段，未见临床报道。
最近采用转基因动物作为AD模型的Aβ免疫治疗法，在动物试验上取得疗效后，已进入临床试验。Schenk等[86]用Aβ42免疫PDAPP小鼠发现能 抑制小鼠大脑中β淀粉样斑和相关的营养不良轴突的形成，紧接着小鼠Aβ42免疫法在几个实验室均取得成功。鉴于免疫治疗在转基因小鼠模型上取得的良好效 果，临床试验已经启动。在这些研究中使用的抗原，即AN-1792（Elan制药公司/Wyeth），是含有合成的Aβ42和佐剂（QS-21）的混合物。两个I期临床试验已完成，它们评价了AN-1792对AD病人的安全性和耐 受性。第一个是使用三个逐级提高的单独Aβ42剂量水平，佐剂的浓度是固定的。每一剂量组有8个病人，其提高剂量的间隔为6周。第二个I期临床试验是多剂 量（Aβ42和QS-21佐剂的剂量都在变）增加的研究，每个剂量水平之间的间隔为2~3月。
在这两个研究中，AN-1792具有良好的耐受性，Ⅱa期临床试验已经在美国和欧洲开始。Ⅱa期临床试验招募到375个AD病人，在主动治疗组 （n=300）已接受最高剂量Aβ42和最低剂量的在I期临床使用的QS-21。然而，这个试验由于出现了无菌性脑膜炎而被迫在2002年1月终止。所有 受影响的病人接受了1~3个剂量的AN-1792，并且他们的症状从最后一次接受药物注射后一直持续了5天到5个月不等。尽管AN-1792的没有继续进 行，但剩下的病人没有终止，并且这些病人将继续被监控其安全、中枢神经系统变化、认知状态和免疫功能1年。
这些副反应是没有预料到的，在5个不同种类的动物包括灵长类上所做毒性实验没有揭示脑炎和任何其它的副反应，在Ⅱa期临床试验开始时，接受I期临床实验 64个病人中没有一个产生了大脑炎症的症状。Ⅱa期临床试验中的一些病人出现的这个反应明显与免疫反应相联系，尽管其潜在的机制还没有找到。继续进行的测 试正在调查Ⅱa期临床试验中一些病人身上出现的反应是否与免疫反应相关，例如T细胞介导的针对AN-1792的免疫反应。虽然AN-1792没有继续进行 下去，由于引人注目的临床资料，人们还是在积极地追寻着安全、有效的免疫治疗方法。几个与AN-1792有很大不同的第二代免疫治疗产品正在活跃地研制之中。
尽管疾病的一些重要标志物，如Aβ沉积和SP已在AD小鼠中出现，转基因小鼠也不能完全模拟出人类AD所观察到的所有特征。现在仍有争论是这些小鼠能否显 示出AD其它的一些明显而重要的特征，包括突触数量的减少，神经元的死亡或损失。这是由于AD的进程中可能包括各种不同病理途径的复杂的相互作用。APP 本身的过度表达产生的作用可能在转基因鼠中是一个模糊的部分，因为在一些APP基因过度表达的小鼠中缺乏神经元损失的特征，其原因可能是由于增加的 APP，同样导致潜在神经营养性APPs片段的增加。而产生的APPs-α，能阻止细胞的死亡。
即使已有的数据已表明鼠的大脑能重演AD的病理过程，但一些在AD转基因小鼠上发生的生物学效应并不同于人类的AD，例如，基因流行病学研究表明 ApoE4是AD的一个危险因子，但是在表达人类ApoE亚型而不含鼠ApoE的转基因鼠，早期Aβ沉积明显下降。另一个缺陷的是NFT仍没有在现有的 APP和PS转基因鼠中找到，尽管小鼠体内异常的APP表达促进了tau蛋白的磷酸化，是NFT早期的改变。转基因小鼠中NFT的缺乏及没有神经元、突触 的缺失和炎性反应，也不能正确地反映人类大脑中所发生的情况。因此，制备新的AD转基因小鼠，如通过杂交使小鼠具备AD的各种各样的突变基因以及其它的一 些痴呆如 FTDP-17正在被考虑之中。后者在tau基因上发现了突变，值得注意的是FTDP-17病人的大脑并不出现Aβ沉积，但表现出tau各种病理形式，包 括有主要的tau病理改变——NFT。大多数AD患者是散发性的，并没有出现遗传学上的基因突变，只有不到10%的AD患者具有家族性，而其中的多数也未 能发现基因突变，因此转基因动物模型能模拟出AD发病的遗传学因素，不能代表人类其它的AD发病类型，特别是晚期发病的AD形式。
开发有效治疗AD化合物的前提条件是要有一个可靠的、能最大限度模拟AD的动物模型。遗传学研究提供了确切的和假设的AD致病基因，使人们能设计和制备出 新的同时转入多个基因的小鼠。将两种转基因动物进行杂交制备一种既有SP又有NFT的动物模型，或在转基因动物的基础上用药物的方法加强或产生某一方面的 病理变化，这也是制备AD模型的一个方向。APP/PS突变小鼠与FTD突变tau小鼠杂交将产生一种具备两大病理特征的模型，这种方法或许有良好的前 景。但需要将这些和/或其它基因同时构建到一个转基因载体中，使转入的每一个基因得到相等的表达。除了使用转多基因的小鼠来加速和增加模型小鼠的病理改变 外，其它制备AD转基因动物模型的策略是使用药物或特殊的神经解剖损伤加重或削弱某个神经病理特征。或许将一些非转基因模型中使用的干扰因素加入到转基因 模型中，可能会改进转基因动物模型。也许有必要在小鼠脑内模拟炎性反应（如对Aβ的炎性反应）而达到第二步的神经细胞死亡和反应性胶质增生的目的。另外基 因构建和鼠系的差异同样也影响转基因鼠的表型。转同样基因的小鼠，不同的鼠系影响其表型，很明显鼠系的背景对于每一个在研的转基因小鼠都应仔细研究。为了 解决不同APP转基因鼠表型上的不一致，相关的一些实验室需要进行更广泛的合作。鼠系必须在同一标准的基因背景下，使用相同的分析方法，以建立标准的转基 因动物模型。在更可靠、更准确的理想动物模型出现以前，就现有的AD动物模型而言，用两种比较贴近AD的动物模型同时进行药物筛选或许比用单一模型来筛选 药物更有说服力，这样能更快将药物推向临床。不同的单一模型虽只模拟部分病理改变，但可以根据模型发生的病理变化，针对不同作用靶点和机理进行药物筛选。 另一种方法是把多种制作单一模型的方法合理相加来模拟AD复杂的病因，用这种多重复制的方法制作AD模型可能也是一个未来发展的方向。
另一个需要关注的问题是如何评价AD模型出现的行为学改变？怎样反映在AD病人所观察到的认知障碍？关于动物行为，其影响因素很复杂，而且易变，能被许多 不同的遗传背景所影响，同时也受到环境因素所干扰]，因此，特别是采用不同鼠系制作的转基因动物只有对各种各样的变量尽可能提供足够的对照，才能理解因素 之间复杂的相互作用。此外，需要进一步规范当前记忆测试系统，即“鼠化”人的行为学研究。例如，对现在老年人和AD病人所用的记忆测试方法应容易转变为鼠 的测试方法，如迷宫用于测试空间记忆。但这些测试方法只限于空间记忆测试，对于人类这种具有语言的高级生物，使用的是第二信号系统，不仅仅是空间记忆的丧 失，还包括推理、抽象化和语言等方面能力的缺陷，而现有的迷宫记忆测试是无法模拟出AD诸多方面认知缺陷的，这需要人们寻找更有效的认知测试方法来最大限 度地检测出AD动物模型的各种认知障碍。
总之，良好的AD动物模型最终将使AD的研究进入一个崭新的时代，它将大大地加速AD治疗药物筛选的进程。由于人和动物之间存在着差异，即便某个AD动物 模型完全具备了人类AD的所有特征，通过该AD模型筛选到的“有效药物”也未必对AD病人一定有效。最终还是要通过AD病人的临床试验予以确认，这才是最 有说服力的试验，才能最终解决问题。
