羊膜细胞的培养（二）
胸腺嘧啶核苷同步化收集
1. 在收集细胞的前一天早上，用添加胸腺嘧啶核苷（用 D-PBSA 制备 15 mg/ml 储备液，过滤除菌。将 0.1 ml 胸腺嘧啶核苷储备液加入到 10 ml 培养液中。在收集细胞前更换使用胸腺嘧啶核苷培养液。在培养液中的终浓度应为 0.15 mg/ml）的培养液换液（胸腺嘧啶核苷的终浓度为 0.15 mg/ml )。
2. 收集细胞当天的早些时候，用预温的培养液浸洗去除胸腺嘧啶核苷。然后，倒掉培养液，将细胞浸洗两次。加入 1 ml 不含胸腺嘧啶核苷的培养液，这种培养液可缓解胸腺嘧啶核苷的阻断作用。缓解时间取决于计划收集细胞的时间。
3. 将细胞培养 4 h ，然后加入 0.1 ml 稀释的秋水仙酰胺。
4. 将细胞继续培养 2 h ，然后按照培养管常规收集法收集细胞（按照本方案前述的培养管内细胞的常规收集，从操作步骤 2 开始）。
溴脱氧尿核苷秋水仙酰胺过夜收集
1. 在收集的前一天早上更换培养液。
2. 同天下午在每 1 ml 培养液中加入 0.1ml BUdR-秋水仙酰胺液（BUdR 的终浓度为 25 μg/ml，秋水仙酰胺为 0.04 μg/ml )。
3. 次日早上（处理约 20 h 后），将 BUdR-秋水仙酰胺液倒入含有金精石的可密封容器中。然后，将 2 ml 预温的 TE 液加入培养管，孵育 3 min，使细胞脱落。
4. 检査到细胞已悬浮时，加入 7 ml 0.075 mol/L KCl 低渗溶液。将细胞培养 5 min。
5. 离心（150 g，5 min )。
6. 将低渗上清液倒入金精石容器中。
7. 轻轻混悬细胞，按本方案前述的培养管内细胞常规收集，从操作步骤 6 开始缓慢固定细胞和继续收集。
制备玻片
1. 使用清洁的玻片。可以购买预清洁的玻片。使用前在每张玻片上加 1 滴新鲜固定液，立即用纸巾擦净，这有助于清洁玻片。如能够控制周围的环境，应在 20~25°C 和 40%~50% 相对湿度的环境下制备玻片。
2. 从 1~3 cm 的高度将 1 滴细胞悬液滴加在每张玻片上。使液滴自然晾干。
3. 用相差显微镜确定分散质量。如果分散满意，可制备其余的玻片。如有必要，在细胞悬液中再加入少量固定液，调整细胞密度。
4. 在某些情况下，需改进分散方法，以下的建议可能是有帮助的。
(a)先在玻片上吹一口气，然后从 1~3 cm 的高度将 1 滴细胞悬液滴加在玻片上。使液滴自然晾干。
(b)无论在玻片上吹气或不吹气，将 1 滴细胞悬液加在玻片上。放置几秒钟后，在液滴尚未干燥前，再加滴 1 滴新鲜固定液。然后，使玻片晾干。
(c)不管在玻片上吹气或不吹气，将 1 滴细胞悬液加在玻片上。放置几秒钟。当干燥的表面凹陷或可见 Newton 环时，将 1 滴新鲜固定液加在上面。使玻片晾干。
(d)如果分散质量还不满意，将固定的细胞悬液放在冰箱中固定过夜。第 2 天再制备玻片。
用胰蛋白酶进行 G 带显带
1. 可在胰蛋白酶（将 10 ml 超纯水加入小瓶中，按照产品使用说明配制 5% (w / v ) 胰蛋白酶液）消化前预处理玻片，但依据玻片的制备后时间也可不作处理。新鲜制备的玻片用过氧化氢预处理效果好，而制备时间较长的玻片用浓 Hank’s 盐溶液预处理效果好。Coplin 缸是合适的染色器皿。也可以使用未作预处理的玻片。
2. 可采用以下的预处理方法。
(a)用 5 % 过氧化氢将新鲜制备的玻片（晾干后 1 h ) 浸泡 20 s~2 min 。
(b)用 60°C 烘箱将新鲜制备的玻片烘烤数小时或过夜，使玻片老化。然后，在 5×HBSS 中将玻片浸泡 5 min。
(c)在 pH 6.8 的缓冲液中将制备后 1 天或较长时间的玻片浸泡 60 s。
3. 用 pH 6.8 的缓冲液将玻片充分浸洗。
4. 用盐溶液配制的 0.14% 胰蛋内酶浸泡玻片 3 s~2 min。
5. 用 pH 6.8 的缓冲液将玻片充分浸洗。
6. 染色前用 pH 6.8 的缓冲液稀释 Leishman 染液（1 : 4 ) （通常用 4 份 pH 6.8 的缓冲液稀释 1 份 Leishman 染液）， 然后将玻片染色 4 min。
7. 用自来水冲洗玻片，然后引流掉或小心吸干水分。
8. 在 400× 亮视野显微镜下分析显带结果。如果显带较暗，可用 pH 6.8 的缓冲液或甲醇脱色，并可重复操作。如果显带过度，用另外的玻片，采用不同的胰蛋白酶处理时间或改变预处理方法，重新操作。
9. 将玻片在热盘上 ( 75°C ) 放置数秒钟，以保证玻片完全干燥。然后，用 DPX 和盖玻片封片。
染色体制图在本章后面叙述（见方案 27. 9)。
注意事项
1. 安全提示
(a)戴手套和穿实验衣。所有样本都应在 Ⅱ 级微生物安全柜中的无菌条件下处理。
(b)应将丢弃的培养液和低渗上清液（但不是固定液）倒入消毒溶液中，如 Virkon 或次氯酸盐。固定液应倒入碳酸氢钠溶液中，以便使酸中和。2 h 后，将这两种废液倒入有充足流水的排水系统。
(c)溴脱氧尿核苷（BUdR ) 是一种已知的诱变剂，可选择使用。在从事涉及这种化学制削的任何工作前，应当承诺适当的当地安全评价（如 COSHH )。可将含有过量化学物质的溶液和上清液倒入盛有金精石或类似吸收物质的可密封容器中，然后焚化处理。
(d)固定和准备玻片时使用甲醇和乙酸的操作应在烟雾通风橱中进行。
2. 注意事项
(a)通过用胰蛋白酶分散细胞克隆能促进细胞的快速生长（见下面的分散和传代方法）。如果需要大量的细胞，将细胞传到几个 Leighton 管或培养瓶，以有利于细胞生长，获得较多细胞。
(b)血染羊水样本的细胞生长不如清澈样本好。处理这种样本的一种方法是利用密度梯度离心（如 Histopaque ) 将羊膜细胞与污染的红细胞分离。
(c)如果不先吸去血染的培养液，在 6~7 天评估严重血染样本的细胞生长情况通常是不可能的。可将培养液收集入另外的试管中。如果原有试管的细胞能够生长， 可将收集的培养液丢弃。如果需要， 也可将收集的培养液进一步培养。
(d)无论如何不希望丢弃原来的细胞悬液时，在第 1 次换液时可增加试管培养。
3. 注意事项
(a)可在 -20°C 条件下储存不同固定阶段的固定细胞悬液。在制备玻片前换固定液 2 次。
(b)当选择传代或只剩下 1 个培养管时，可采用保留收集法。这种方法需要在收集的开始阶段加入无菌的秋水仙酰胺和 TE 液。在细胞脱落后，加入低渗溶液前，将细胞移入另 1 个离心管。在原始培养管中加入新鲜培养液。第 2 天当细胞贴壁后应更换培养液，以便除去残留的胰蛋白酶和秋水仙酰胺。
(c)如果收集的细胞中的分裂中期细胞过少，可选择使用以下方法：
(i)将细胞传到培养瓶中。当细胞附着时，将培养瓶与水平面保持轻微的角度。用这种方法斜置培养瓶能使前缘细胞横跨整个培养瓶的宽度，前缘细胞的生长速度总是很快。
(ii)用低浓度的秋水仙酰胺处理细胞过夜。
(d)可通过胸腺嘧啶核苷同步化或在有溴脱氧尿核苷的条件下经秋水仙酰胺过夜处理，产生用于高分辨分析的较长染色体。然而，这两种方法对于指数生长期细胞的效果很有效，并需要对细胞生长作出细致评价。
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