原代细胞基本实验技术小结
A 原代细胞分离技术
取人或动物体内（或胚胎）的组织，将其剪碎至1mm3的组织块，再采用的如下方法进行分离培养：
一、悬浮细胞的分离方法
1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法
1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
2、用PBS清洗两次后
①用吸管吹打，分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
（二）消化分离法
1、酶消化分离法（过夜冷消化法）
①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
③加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。
④次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
B 原代细胞无血清培养技术
1、弃去培养基废液。
2、消化：加入1ml 0.125％胰酶溶液，转动培养瓶使酶液浸没瓶底，温浴消化2-3分钟。
3、终止：用无血清培养基终止酶反应。
4、离心：收集中和了的培养液，于15ml 的离心管中 1000rmp 离心10分钟。
5、细胞重悬：弃去上清，加入1ml 无血清培养基用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液。
6、细胞计数：血球计数板计数细胞，并换算出细胞数量。
7、接种分瓶： 将细胞接种到含4ml无血清培养基的培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱中培养。
8、镜检观察：次日观察贴壁率，细胞形态等。
C 原代细胞培养技术
一、组织块直接培养法
1、取材，用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成1mm3左右的小块，再用Hank’s液洗三次。
3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。
4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。
5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
二、消化培养法
1、取材，用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成1mm3左右的小块，再用Hank’s液洗三次。
3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。
5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
7、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。
9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。
三、 器官培养
1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。
2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。
3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2。
4、将上述准备好的培养物放入CO2培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。
5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。
6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。
D 原代细胞传代技术
一、贴壁细胞的消化法传代
1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。
2、加入1ml左右消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时，弃去消化液，加入培养液终止消化。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
二、悬浮细胞的传代
1、直接传代
① 让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3。
② 用吸管吹打形成细胞悬液后，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。
2、离心法传代
① 将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心800-1000rpm，5分钟。
② 去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液。
③ 将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。
E 原代细胞染色技术
一．台盼蓝染色
（1）制备单个细胞悬液，并作适当稀释（106细胞/ml)。
（2）染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加一滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
（3）计数：在3分钟内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。
（4）镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。
（5）根据下式求细胞活力:
二．伊红Y染色
（1）制备1×106-5×106细胞／ml的细胞悬液。
（2）取0.1ml细胞悬液加0.1ml伊红Y染液混合。
（3）用计数板镜下计数活、死细胞数。
（4）镜下观察，着红色的为死细胞。按公式计算细胞活力。
三．苯胺黑染色实验
（1）制备1×106-5×106细胞／ml的细胞悬液。
（2）将1份1%苯胺黑溶液与含血清生理盐水作1：9混合稀释，使其成0.1%苯胺黑染液。
（3）取0.1ml细胞悬液加0.1ml苯胺黑染液混合。室温放置10分钟。
（4）用计数板镜下计数 ，黑色细胞为死细胞，按公式计算活细胞率。
F 原代细胞计数技术
1、准备计数板：用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后轻轻拭干。
2、制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，2分钟），重悬浮于少量培养液中。
3、加样：用习惯轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。
4、计数：计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000。
G 原代细胞鉴定技术
一、形态学鉴定
1. 在倒置显微镜中直接观察活细胞的形态学特征
2. 细胞染色检查 ：
a) 将无菌玻片置于细胞培养皿中，加细胞悬液后培养；
b) 待细胞长满玻片后取出，用PBS清洗，之后放于载玻片上，待其自然干燥；
c) 用PBS/甲醇（1:1）固定15分钟；
d) 弃固定液，加合适的染色液染色；
e) 染色完毕后用清水洗净，置于空气中干燥，
f) 干燥后，用二甲苯透明，光学树脂封片后观察。
二、免疫组织细胞化学鉴定
1. 将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片；
2. PBS清洗标本3次，各1 分钟；
3. 4%多聚甲醛固定15分钟；
4. 置于空气中干燥；
5. PBS清洗标本3次，各2 分钟；
6. 0.5%Triton X-100孵育 1次20分钟；
7. PBS清洗标本 3次 各2分钟；
8. 3%H2O2孵育 15分钟；
9. DPBS清洗标本 3次 各2 分钟；
10. 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液20分钟）
11. 一抗孵育，4℃ 过夜或37℃ 60 分钟；
12. PBS清洗标本3次 各5 分钟；
13. 二抗工作液孵育（湿盒）37℃ 30 分钟；
14. PBS清洗标本3次 各5 分钟；
15. C液（湿盒） 37℃ 30 分钟；
16. PBS清洗标本3次，各5 分钟；
17. 用显色液进行显色；
18. 蒸馏水洗涤2次1 分钟；
19. 苏木素复染1分钟；
20. 清水洗涤30分钟；
21. 光学树脂封片后观察。
H 原代细胞冻存技术
1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。
2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。
3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。
4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）×106/ml。
5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。
8、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。
I 原代细胞复苏技术
1、取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。
2、吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。
3、1000r/分钟离心5分钟，去除上清。
4、用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2培养箱静置培养。
镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液，继续培养。
