原代细胞基本实验技术小结（一）
A 原代细胞分离技术
取人或动物体内（或胚胎）的组织，将其剪碎至1mm3的组织块，再采用的如下方法进行分离培养：
一、悬浮细胞的分离方法
1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法
1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
2、用PBS清洗两次后
①用吸管吹打，分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
（二）消化分离法
1、酶消化分离法（过夜冷消化法）
①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
③加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。
④次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
B 原代细胞无血清培养技术
1、弃去培养基废液。
2、消化：加入1ml 0.125％胰酶溶液，转动培养瓶使酶液浸没瓶底，温浴消化2-3分钟。
3、终止：用无血清培养基终止酶反应。
4、离心：收集中和了的培养液，于15ml 的离心管中 1000rmp 离心10分钟。
5、细胞重悬：弃去上清，加入1ml 无血清培养基用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液。
6、细胞计数：血球计数板计数细胞，并换算出细胞数量。
7、接种分瓶： 将细胞接种到含4ml无血清培养基的培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱中培养。
8、镜检观察：次日观察贴壁率，细胞形态等。
C 原代细胞培养技术
一、组织块直接培养法
1、取材，用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成1mm3左右的小块，再用Hank’s液洗三次。
3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。
4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。
5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
二、消化培养法
1、取材，用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成1mm3左右的小块，再用Hank’s液洗三次。
3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。
5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
7、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。
9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。
三、 器官培养
1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。
2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。
3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2。
4、将上述准备好的培养物放入CO2培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。
5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。
6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。
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