原代细胞基本实验技术小结（二）
D 原代细胞传代技术
一、贴壁细胞的消化法传代
1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。
2、加入1ml左右消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时，弃去消化液，加入培养液终止消化。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
二、悬浮细胞的传代
1、直接传代
① 让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3。
② 用吸管吹打形成细胞悬液后，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。
2、离心法传代
① 将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心800-1000rpm，5分钟。
② 去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液。
③ 将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。
E 原代细胞染色技术
一．台盼蓝染色
（1）制备单个细胞悬液，并作适当稀释（106细胞/ml)。
（2）染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加一滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
（3）计数：在3分钟内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。
（4）镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。
（5）根据下式求细胞活力:
二．伊红Y染色
（1）制备1×106-5×106细胞／ml的细胞悬液。
（2）取0.1ml细胞悬液加0.1ml伊红Y染液混合。
（3）用计数板镜下计数活、死细胞数。
（4）镜下观察，着红色的为死细胞。按公式计算细胞活力。
三．苯胺黑染色实验
（1）制备1×106-5×106细胞／ml的细胞悬液。
（2）将1份1%苯胺黑溶液与含血清生理盐水作1：9混合稀释，使其成0.1%苯胺黑染液。
（3）取0.1ml细胞悬液加0.1ml苯胺黑染液混合。室温放置10分钟。
（4）用计数板镜下计数 ，黑色细胞为死细胞，按公式计算活细胞率。
F 原代细胞计数技术
1、准备计数板：用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后轻轻拭干。
2、制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，2分钟），重悬浮于少量培养液中。
3、加样：用习惯轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。
4、计数：计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000。
G 原代细胞鉴定技术
一、形态学鉴定
1. 在倒置显微镜中直接观察活细胞的形态学特征
2. 细胞染色检查 ：
a) 将无菌玻片置于细胞培养皿中，加细胞悬液后培养；
b) 待细胞长满玻片后取出，用PBS清洗，之后放于载玻片上，待其自然干燥；
c) 用PBS/甲醇（1:1）固定15分钟；
d) 弃固定液，加合适的染色液染色；
e) 染色完毕后用清水洗净，置于空气中干燥，
f) 干燥后，用二甲苯透明，光学树脂封片后观察。
二、免疫组织细胞化学鉴定
1. 将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片；
2. PBS清洗标本3次，各1 分钟；
3. 4%多聚甲醛固定15分钟；
4. 置于空气中干燥；
5. PBS清洗标本3次，各2 分钟；
6. 0.5%Triton X-100孵育 1次20分钟；
7. PBS清洗标本 3次 各2分钟；
8. 3%H2O2孵育 15分钟；
9. DPBS清洗标本 3次 各2 分钟；
10. 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液20分钟）
11. 一抗孵育，4℃ 过夜或37℃ 60 分钟；
12. PBS清洗标本3次 各5 分钟；
13. 二抗工作液孵育（湿盒）37℃ 30 分钟；
14. PBS清洗标本3次 各5 分钟；
15. C液（湿盒） 37℃ 30 分钟；
16. PBS清洗标本3次，各5 分钟；
17. 用显色液进行显色；
18. 蒸馏水洗涤2次1 分钟；
19. 苏木素复染1分钟；
20. 清水洗涤30分钟；
21. 光学树脂封片后观察。
H 原代细胞冻存技术
1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。
2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。
3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。
4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）×106/ml。
5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。
8、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。
I 原代细胞复苏技术
1、取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。
2、吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。
3、1000r/分钟离心5分钟，去除上清。
4、用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2培养箱静置培养。
镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液，继续培养。
