一小时 DDA 鉴定 DIA 定量 4000 个 Hela 蛋白（二）
500 ng Hela 细胞裂解液用相同的色谱柱，相同的色谱梯度，将 QE HF 切换至 DIA 扫描模式进行 3 次 DIA 数据采集。在一次扫描循环中，目标母离子质核比范围 400–1000，四极杆的隔离窗口为 12 Da，包含 50 次 MS/MS 扫描。每一张 MS/MS 谱图中包含了 12 Da 窗口内的所有母离子的碎片离子信息。QE HF 使用了超高场的 Orbitrap，扫描速度是 20 Hz，所以每次循环所用的时间约为 2.4–3 s，与色谱兼容（图 2）。Skyline 处理 DIA 数据时从谱图库中选取强度最高的多个碎片离子进行色谱峰抽提。Skyline 中嵌入的 mProphet 软件会根据同一肽段的多个子离子峰的 feature 进行打分。Feature 包括子离子共流出峰形、保留时间偏差、dotp 值、信噪比等。为了区分假阳性的子离子峰，mProphet 可以建立 decoy 库，也可以将打分排名第二的肽段作为 decoy，计算 FDR[5,6]。筛选 FDR < 0.01 的肽段段作为可信的定量肽段（图 1）。
图 2. QE HF 扫描目标质核比窗口 400–1000 采集 50 张 MS/MS 所需时间在 2.4–3 s
2. DDA 鉴定结果以及谱图库建立
500 ng Hela 细胞进行 60 min 色谱梯度进行 DDA 数据采集。在 60 min 内，三次重复，QE HF 分别采集到 49065、49031、48885 张谱图，鉴定到 22030、21820、21654 个肽段，对应到约 3909、3900、3878 个蛋白。将三次的肽段和蛋白合并，一共鉴定到 32446 个肽段，4510 个蛋白（图 3）。蛋白和肽段鉴定结果导入 skyline 建立谱图库。通过该谱图库，在 skyline 中建立需定量的候选肽段和蛋白。为了提高蛋白定量的准确性，在 skyline 中设置一些肽段的限制条件，m/z 400–1000，母离子电荷 2+– 4+，无漏切位点。32446 个肽段中符合这些条件的肽段有 29686 个，对应 4296 个蛋白。在 DDA 定量实验中，为每个候选肽段添加强度最高的 3 个同位素峰（M、M+1、M+2）作为定量离子，共生成 89027 个定量离子。在 DIA 定量实验中，为每个肽段添加 5 个强度最高的子离子（b3-bn，y3-yn）,共生成 145736 个定量离子。
图 3. 500 ng Hela 细胞裂解液 3 次 DDA 鉴定结果（A）鉴定到的蛋白交盖图（B）鉴定到的肽段的交盖图
3. 基于母离子的 DDA 定量和基于子离子的 DIA 定量结果比较
对于 DDA 定量，skyline 会从 DDA 数据一级谱图中进行母离子同位素峰抽提。筛选同位素分布与理论同位素分布较好的肽段作为可靠的定量肽段，即 idotp > 0.8。由于 DDA、DIA 实验中用的是相同的色谱梯度，DDA 实验中肽段的保留时间信息可以传递给 DIA 实验。所以在 DIA 定量时，限制 skyline 只抽提该肽段谱库中保留时间 5 min 范围内的子离子。通过保留时间限制可以降低 DIA 数据处理的复杂度和提高定量的准确度。同时筛选 Q value < 0.01 的肽段最为可靠的定量肽段。
三次 DDA 实验从一级谱图中分别定量到 25214、25515、24873 个肽段；3969、3975、3917 个蛋白；定量到的肽段占总候选肽段的 84%；峰面积的 CV 值在 20% 以下的占总定量肽段的 58.81%；CV 值在 10% 以下的占 25.25%（图 4）。三次 DIA 定量分别定量到 27558、27604、27483 个肽段；4067、4080、4073 个蛋白。定量到的肽段张总候选肽段的 93%；峰面积的 CV 值在 20% 以下的占总定量肽段的 90.3%；CV 值在 10% 以下的占 69.01%（图 5）。可以看出 DIA 能够定量到更多的肽段，而且定量肽段的峰面积 CV 值远远小于 DDA。
图 4. 3 次 DDA 实验和 3 次 DIA 实验定量到的肽段和蛋白
图 5. DDA 定量和 DIA 定量母离子和子离子峰面积 CV
结论
DDA 一般用于蛋白/肽段鉴定，同时可以基于母离子进行的定量，在非常复杂的基质中，非常容易受到其他肽段的干扰，导致定量不准确，CV 值过大。DIA 定量是基于二级子离子的定量，用子离子定量会提高定量的选择性，降低其他肽段的干扰，定量会比基于一级峰面积的定量更加准确， CV 值较小。该实验中，用 500 ng Hela 细胞裂解液评价 DDA 定量和 DIA 定量能力。3 次 DDA 实验鉴定到 32446 个肽段，4510 个蛋白。将鉴定到的蛋白和肽段导入 skyline 建立谱图库，筛选出 4296 个候选定量蛋白，29686 个候选定量肽段，作为 DDA 和 DIA 共同定量目标。DDA 定量到了 84% 的肽段，92% 的蛋白；而 DIA 定量到了 93% 的肽段，95% 的蛋白。DIA 比 DDA 能定量到更多的肽段和蛋白，同时 DIA 定量子离子峰面积的 CV 远远小于 DDA 定量母离子峰面积的 CV。结果表明，基于二级子离子的定量要由于基于一级母离子的定量。
QE HF 在一小时梯度内就能从 500 ng Hela 细胞裂解液鉴定并定量 4000 个蛋白，这得益于 QE HF 较好的离子传输效率，超快的扫描速度。目前 DIA 定量基于一维反向色谱质谱联用分析还不适用于二维色谱质谱联用分析。但是可以通过延长一维反向色谱的梯度，提高分离效率达到细胞蛋白质组的全覆盖。Matthais Mann 研究小组 2014 年用一维反向色谱在小鼠 NSC-34 和 N2a 细胞裂解液 240 min 色谱图梯度，就鉴定到了 8000 多蛋白，基本上达到细胞系蛋白组全覆盖[7]。通过 DDA 鉴定肽段蛋白，建立谱图库，DIA 进行蛋白定量可能成为定量蛋白质组学新的发展方向。
参考文献
1. Gillet, L C. et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics, 2012, 11(6): O111 016717.
2. Kelstrup, C D. et al. Rapid and deep proteomes by faster sequencing on a benchtop quadrupole ultra-high-field orbitrap mass spectrometer. J Proteome Res, 2014, 13(12):6187-6195.
3. Scheltema R A. et al. The Q Exactive HF, a benchtop mass spectrometer with a pre-filter, high performance quadrupole and an ultra-high field orbitrap analyzer. Mol Cell Proteomics, 2014, 13(12):3698-3708
4. Abbatiello S E. et al. Design, implementation, and multi-site evaluation of a system suitability protocol for the quantitative assessment of instrument performance in LC-MRM-MS. Mol Cell Proteomics, 2013, 12(9):2623-2639
5. Reiter, L. et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat. Methods.2011，8 (5):430-435
6. Röst H L. et al. OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS-data. Nat. Biotechnol. 2014, 32(3):219-223
7. Horburg D. et al. Deep Proteomic Evaluation of Primary and Cell Line Motoneuron Disease Models Delineates Major Differences in Neuronal Characteristics. Mol Cell Proteomics, 2014, 13(12):3410-3420
