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用冻融法制备的Nycodenz予形成梯度分离细胞器

2020.7.14

用密度梯度离心分离亚细胞构造往往需要预先制备蔗糖或其他合适梯度材料的密度梯度，操作比较复杂。利用新型的梯度材料Nycodenz (Norway，Nycomed pharma AS公司)用冻融法制备凸指数与凹指数共存的曲线梯度，利用超速离心机的水平转头可以简便地分离出亚细胞构造中线粒体，高尔基复合体，内质网（滑面及糙面），溶酶体及过氧化酶体。离心分部收集后分别做SDS—PAGE电泳可以明显地看出细胞器的分布情况。
设备：超速离心机（日立CP—MX,CP—WX或其他品牌新型机）
转头：R28S 甩平转头
离心管：40PA
密度梯度仪：日立DGF—U用于自上而下从离心管抽出分离液至分部收集器
分部收集器、密度测定设备、电泳仪等常规设备。
样品：鼠肝匀浆，每管加3.5ml （浓度—14mg/ml ）
步骤：
1．Nycodenz梯度制备：
每管用Nycodenz 稀释配置液20％ w/v (1.105g/ml) 32ml 放入－20℃冰箱冻结。全部冻结后取出室温中融化即成为（从液面到管底）密度从1.04g/ml 到 1.27/ml 的曲线型（从 1.05g/ml 到1.13g/ml 为凸指数型，从 1.13g/ml 到1.27g/ml 为凹指数曲线）连续梯度。
2．加样：在连续梯度上铺样品至距管口3mm（约3.5ml）
3．离心：日立R28S甩平转头，6×40ml 钛合金吊桶，40PA管，25,000rpm (82,200xg)，4℃离心3小时，加速“8”，减速“7”
4．收集：离心后每管分别用日立DGF—U上取法自动收集至分部收集器也可以人工收集（自上而下），收集管每管约0.5—0.75ml （即40PA 离心管收集成52—78管）
5．测密度：测定每管的密度值，按管数→密度绘成曲线
6．电泳：每管取3 ul 做SDS—PAGE 电泳，并标定管数对应密度及分子量的重叠曲线。
7．分析：根据密度分布可以绘出高尔体复合体，滑面内质网，糙面内质网线粒体，溶酶体及氧化酶微体（注意内质网和微体由于他们的密度及大小不同，可能都会有二个区域的分布）的分布区域，由于它们在Nycodenz 中浮密度的重叠，分布的区域也会有所重叠。