RNA抽提注意事项和经验指南-2
3：裂解液的选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素
常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。
4：纯化方法的选择 – 影响内源杂质残留。抽提速度的因素
对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响
RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。
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问题解答 (外源性污染导致的问题不在本解答考虑中。防止外源性污染的办法见 ‘Rnase 污染的10大来源’)
RNA 的降解
理论上 28S:18S = 2.7:1，实践中达到该比值几乎没有可能，并且没有必要。降解的标志是：28S:18S < 1。下面是最常见的导致 RNA 降解的原因及正确的做法：
新鲜细胞：如果试剂没有问题，外源性污染也可以排除的话，降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞的话，一定要使裂解液能盖住细胞。
新鲜组织：某些富含内源酶的样品 (如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免 RNA 的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。这些样品使用玻璃匀浆器匀浆更不可靠。
冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至 – 70C 冰箱保存。样品要相对小一点。样品决不能不经液氮速冻而直接保存于 –70C
冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下碾磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA
比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以碾磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品碾碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
A260 /A280 比值低
蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机项。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法是用 PCI 重新抽提一次，再沉淀，溶解。
苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机项。加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法是再沉淀一次后，溶解。
设备限制：测定 A260 及 A280 数值时，要使 A260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。
用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。
A260 /A230 比值低
抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。解决办法是再沉淀一次后，溶解。
组织内杂质残留：一般为多糖类杂质。解决办法是改用其它办法，如 LiCl 沉淀。
设备限制：测定 A260 及 A280 数值时，要使 A260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。
奇怪的电泳带型
非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。使用 2ug
上样量，电压小于 6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以 DNA 标准为参照，28S 和
18S 分别位于 2.0kb 和 0.9kb 左右。)
变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。
下游实验效果不佳
RNA 降解：见上面。
抽提试剂的残留：加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。75% 乙醇洗涤时，一定要使核酸沉淀悬浮起来。更好的是使用两次洗涤，并且在倒掉第二次洗涤液后，再将离心管放入离心机中，离心数秒后，用移液器将残留的乙醇小心吸掉。
样品中杂质的残留：从富含多糖等杂质的样品中抽提 RNA 时，多糖往往同核酸一起被沉淀下来。用水溶解核酸时，发现有一些粉末状不溶物，往往就是多糖。高速离心后，将上清移入另外一个离心管中，再次沉淀核酸，可以减少这些杂质。更好的是使用有针对性的纯化方法。
DNA 污染：在 RNA 抽提操作中，少量 DNA 的污染是正常的，且对大部分下游实验没有大的影响。降低样品起始量或者增加溶液使用量，能将
DNA 的污染降低到电泳看不见的水平。能够彻底去除污染 DNA 的方法只有用 RNase-Free 的 DNase I 消化抽提的
RNA。残留的 DNA 是否影响后续实验，可以用下面的实验检测：以抽提好的 RNA 做模板进行 PCR 扩增：如果不出现目的条带，DNA
的残留无须去除，否则要使用 Dnase I 消化，或者重新试剂引物。
