流行性脑脊髓膜炎病例的菌群鉴定及分析
流行性脑脊髓膜炎(epidemiccerebrospinalmen-ingitis，简称流脑)是一种严重的呼吸道传染病，可引起较高的病死率和致残率。即使在医疗条件比较完善的地方，流脑病死率仍高达5%～10%，10%～15%的幸存者会遗留明显的神经系统后遗症(精神异常、耳聋、瘫痪和惊厥等)，严重危害人类健康［1］。
脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)是流脑的病原菌，根据荚膜多糖化学结构可将其分为13个血清群，其中A、B、C、W135和Y群是引起流脑的主要血清群，以C群毒力最强［2］。多位点序列分型(multilocussequencetyping，简称MLST)是通过对7个管家基因的测序结果，用核苷酸序列变异来发现细菌型别差异的分型方法［3］。由于脑膜炎奈瑟菌分子型别具有基因多态性，MLST作为一项新型分子分型技术，已被广泛应用于脑膜炎奈瑟菌的鉴定研究［4－5］。中国大陆目前主要流行的脑膜炎奈瑟菌菌群是C群ST-4821［6］。为了解2015年河南省1例流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例菌群的分子分型特征，本研究收集患者的脑脊髓液和血液及37例密切接触者的咽拭子和血液，进行多位点序列分型(multilocussequencetyping，MLST)，现将结果报告如下。
1.材料和方法
1．1病例信息
男性，14岁，学生，在学校集体宿舍居住，发病前10d外出史不详。2015年9月18日以“头痛、发热”为主诉收住郑州大学第二附属医院。入院检查:T39．5℃，皮肤有淤点和淤斑等症状，并且伴有颈项强直和意识障碍，克氏征和布氏征均为阳性。实验室检查:血液中白细胞总数达到11．6×109个/L，中性粒细胞高达87%，脑脊液呈混浊状态。2015年9月20日死亡。
1．2标本
患者的脑脊液和血液，37例密切接触者的咽拭子和血液。
1．3主要试剂及仪器
脑膜炎奈瑟菌凝集血清购自ThermoFisher公司;2×PremixExTaq和dH2O均购自Takara公司。APINH生化鉴定试纸条购自法国生物梅里埃公司;A群和C群流脑多糖抗体IgG检测试剂盒购自郑州亿特生物技术有限公司;革兰氏染色液购自BASO公司;血培养瓶、双抗和无抗巧克力平板，均购自郑州安图生物工程有限公司;离心机购自Eppendorf公司;CO2培养箱购自ThermoFisher公司;MagNAPureLC2．0全自动核酸分离纯化系统购自Ｒoche公司;荧光定量PCＲ仪和酶标仪均购自Bio-Ｒad公司;普通显微镜CX41购自奥林巴斯。
1．4细菌培养及血清学鉴定
①将患者脑脊液沉淀接种于无抗巧克力平板，37℃5%CO2进行培养，24h后进行镜检和生化鉴定。②将患者血培养瓶置于37℃5%CO2进行培养，15h后取培养液涂于无抗巧克力平板再进行培养，24h后进行鉴定。③将37例密切接触者的咽拭子接种于双抗巧克力平板，培养24h，挑取可疑菌落接种于无抗巧克力平板继续培养，48h挑取无抗巧克力平板上的菌落进行镜检和生化鉴定。对确定为脑膜炎奈瑟菌的标本，通过血清凝集试验进行分群。
1．5基因分型。
1．5．1DNA提取
按照使用说明书，通过MagNAPureLC2．0全自动核酸分离纯化系统对患者的脑脊液上清、血液和37例密切接触者的咽拭子进行DNA提取。
1．5．2引物的合成
引物和探针序列参照文献［7］，由上海生工生物工程有限公司合成。
1．5．3PCＲ扩增及产物鉴定
使用脑膜炎奈瑟菌属ctrA基因对患者和密切接触者提取的DNA进行检测，再使用流脑分群引物对阳性标本进行分群。荧光定量PCＲ反应体系:PremixExTaq(2×)10μL，上下游引物、探针各1μL，DNA模板2μL，dH2O补足20μL体系。以分别含有ctrA基因、C群特异性基因和B群特异性基因的DNA为阳性对照，dH2O为阴性对照。PCＲ反应程序:95℃2min，95℃5s，60℃20s，共40个循环，在60℃收集荧光信号。Ct值≤35判定为阳性。
1．5．4多位点序列分型引物的设计
参照PubMLST网站上公布的脑膜炎奈瑟菌7个保守基因(abcZ、adk、aroE、fumC、gdh、pdhC、pgm)的引物信息(http://pubmlst．org/neisseria/info/primers．shtml)。PCＲ扩增之后进行测序，测序结果上传到PubMLST数据库进行分析［2］。
1．6密切接触者的抗体水平
按照试剂盒说明书，用A群和C群流脑多糖抗体IgGELISA检测试剂盒对37例密切接触者的血清进行流脑A群和C群抗体水平检测。标准曲线以标准品质量浓度值为x轴，以标准品A450nm值的对数值为y轴，通过四参数Logistic曲线拟合建立标准曲线，根据待测样品的A450nm值回算相应的质量浓度值。质量浓度≥2μg/mL则为阳性，具有免疫保护水平。
1．7统计学分析
采用IBMSPSS19．0软件对37例密切接触者流脑A群和C群抗体水平进行Fisher精确检验，P＜0．05为差异有统计学意义。
2.结果
2．1细菌培养和鉴定镜检及生化鉴定
结果显示，患者的脑脊液、血液和13号密切接触者的咽拭子标本均培养出脑膜炎奈瑟菌，其他36份密切接触者的标本均未见脑膜炎奈瑟菌生长。血清凝集试验结果显示，患者的脑脊髓液和血液均与C群血清凝集，13号密切接触者的咽拭子与B群血清出现凝集。
2．2基因分型
对于ctrA基因，患者脑脊液、血液和13号密切接触者扩增的Ct值分别为21、24和25;对于C群特异性基因，患者脑脊液和血液扩增的Ct值分别为24和26，13号密切接触者未扩增出曲线;对于B群特异性基因，13号密切接触者扩增的Ct值为28，患者脑脊液和血液均未扩增出曲线。这表明患者为C群脑膜炎奈瑟菌，13号密切接触者为B群脑膜炎奈瑟菌，与血清凝集试验结果一致。多位点序列分型结果显示，患者为ST4821型，13号密切接触者为ST5664型，两者均属于ST4821克隆群。
2．3密切接触者的抗体水平
A群流脑抗体阳性率较高，达91．89%，平均质量浓度为6．50μg/mL;C群流脑抗体水平阳性率相对较低，为21．62%，平均质量浓度为1．73μg/mL。A群抗体水平高于C群，差异具有统计学意义(P＜0．01)。
3.讨论
河南省某校的这起流脑事件根据患者的临床症状、流行病学调查以及实验室检测结果，可以确定是一起流脑疫情。对于脑膜炎奈瑟菌的鉴定，PCＲ与细菌培养相比，具有快速、灵敏度高、通量高等多种优点，能够在短时间内对疑似病例进行检测。另外，当患者使用大量抗生素之后，细菌培养可能无法培养出致病菌，会严重影响实验结果。而PCＲ技术，只要患者体内存在脑膜炎奈瑟菌特异性核酸基因，就可以完成检测。研究通过细菌培养和PCＲ两种方法对患者和密切接触者的标本进行鉴定，两者试验结果表明，患者脑脊髓液和血液标本分离的菌株为C群脑膜炎奈瑟菌，密切接触者咽拭子标本分离的菌株为B群脑膜炎奈瑟菌。ST4821克隆群是中国首次出现的一个高致病性序列群，其中包含有多个ST型。通过MLST可以对脑膜炎奈瑟菌进行分子分型［6］。本研究中MLST分型结果显示，患者脑脊髓液和血液标本分离的菌株为ST4821型;其密切接触者咽拭子标本分离的菌株为ST5664型，这与患者致病菌遗传关系相近，同属于ST4821克隆群。通过流行病学调查发现，密切接触者包括患者的同班同学、父母、亲戚和邻居朋友近期都未出现发热、头疼等症状。当地近期也未出现流脑病例。但是患者发病前在流脑一个最长潜伏期(10d)内的外出史不详，无法确定其是否与流脑病人或健康带菌者有过接触。因此，这起流脑疫情并没有发现确切的传染源，可能与外出有关。研究通过对37例密切接触者A群和C群抗体进行检测，发现A群抗体阳性率较高(91．89%)，平均质量浓度为6．50μg/mL，具有免疫保护水平;C群抗体水平阳性率较低(21．62%)，平均质量浓度为1．73μg/mL，低于免疫保护水平，保护力较差，这也是导致这次突发C群流脑疫情的一个重要因素。因此，需在该地区加强A+C群流脑疫苗的接种，以提高C群流脑的免疫水平，同时也需加强对流脑发病趋势的监测，有效预防流脑的暴发。
