酶标法测定碳水化合物含量
实验概要
在真核和原核生物中，糖不仅是重要的能源和结构成分，而且是控制生理、代谢、细胞周期、发育和基因表达的中心调节分子。在高等植物中，糖影响生长和发育的整个生命过程，从种子萌发到开花直至最后衰老。越来越多的证据表明糖作为生理信号，调节着植物基本生理过程的许多基因的表达，包括光合作用、乙醛酸代谢、呼吸作用、淀粉和蔗糖的合成及降解、氮的固定作用、储藏蛋白的合成、病原防御、损伤反应、细胞周期的调节、色素的合成以及衰老反应。本实验用酶标法测定了拟南芥碳水化合物含量。
实验原理
1 mol的己糖经过酶反应，最终转化称6-Phosphogluconat均伴随着1 mo1NADPH的产生，通过测定NADPH在340nm的光吸收，即可测定样品中的己糖含量。
主要试剂
1. 溶液的配制
1mM glucose
1mM fructose
1mM sucrose
500mM TRA buffer pH 7.4 TRA=triethanol amino
2M MgSO4
200 mM ATP
200mM NADP
以上的溶液均需于-20oC保存
Acetate buffer 0.1 M，pH 4.6
10ml 1N acetic acid(醋酸) 5m1 1N NaOH，加dd H20至90m1，调pH至4.6，定容至100mI。
2. 反应混合液(testmix)的配制((1 ml可点96孔，可根据需要配制一定体积，尽量少，因为酶价格较贵)
5ml TRA 500mM，pH 7.4(盐酸二乙醇胺溶于水，1 N NaOH调pH 7.4)
15ul MgS04(2M)
100ul ATP(200mM)
100ul NADP (200mM)
10ul Glucose-6-phosphat Dehydrogenase(G6P-DH，Grad II，140U/ mg)
3. 各种酶的配制
Hexokinase：用水1: 200稀释母液(母液浓度15000U/ml)
Phosphogluco-isomerase：用水1: 200稀释母液(母液配制:350U/mg10mg/ml)
Invertase：0.3mg干粉溶于1 ml醋酸缓冲液(pH4. 6，0.1 M)
Amyloglucosidase：6.09mg/ml (21.3U/mg)
实验步骤
1. 样品制备
1) 用液氮收集植物材料，将材料用冷冻真空干燥仪充分干燥，将干燥后的材料1密封保存在-20oC。
2) 称取2-4mg干燥的材料与l0mg PVPP，lmg活性炭充分混匀，沸水浴20分钟，置于冰上冷却。
3) 加入200ul重蒸水，充分研磨，室温放置25分钟。
4) 10000rpm离心10分钟。吸取100u1上清液，进行可溶性糖的测定。
5) 剩余部分加入100ul醋酸缓冲液(pH4.6 )，混匀后沸水浴15分钟，冷却至室温，加10ul amyloglucosidase充分混合，37oC水浴保温过夜。
6) 离心10min，取出100ul上清液，用作淀粉测定之用(可于-20 oC或-80 oC下保存备用)。
2. 酶标法测定
1) 葡萄糖、果糖、蔗糖的测定
a. 样品配制
按下表将各种成分混合
HG示空白对照，St为标准样品，sample为待测样品
b. 点样
将样品按下表顺序点入96孔比色板
每个样品测3个重复。
c. 测量
将比色板放入酶标仪读取数据，待读数稳定后记录。
取出比色板，将每个孔中加入稀释好的Hexokinase 10ul，放入酶标仪反应30分钟，其间每5分钟测量一次数据，将稳定后的数据记录。取出比色板，将每个孔中加入10ul稀释好的Phosphogluco-isomerase，放入酶标仪反应30分钟，其间每5分钟测量一次数据，将稳定后的数据记录。取出比色板，将每个孔中加入50ul稀释好的Invertase，放入酶标仪反应45分钟，将最后稳定的数据记录。
d. 计算
记录的每组数据及相关的实验参数输入计算软件，即可得到各样品中3种糖的含量。
2) 淀粉的测定
a. 样品配制
将经过Amyloglucosidase消化的样品按下表混合
根据样品淀粉含量的多少，水与样品的比例可适当调整在最后输入软件计算时，实验参数都应相应修改。
b. 点样
方法同上
c. 测量
将比色板放入酶标仪读取数据，待读数稳定后记录。取出比色板，将每个孔中加入稀释好的Hexokinase 10ul，放入酶标仪反应30分钟，其间每5分钟测量一次数据，将稳定后的数据记录。
d. 计算
将记录的每组数据及相关的实验参数输入计算软件，即可得到各样品中淀粉的含量。
