膜片钳常见问题解答（三）
1. 电极拉制程序中具体应该如何控制。在参数设定的摸索中，是否需要每次都用显微镜检测，还是另有更易操作的方法.
答：不同的拉制仪拉制参数的设置不尽相同，你需要阅读说明书，参数中主要是设定拉力（对于P-97拉制仪，只需要设置Velocity，可不用设定Pull）与温度。一般第一步拉制电极颈部，温度要比第二步高（对于P-97拉制仪，温度的设定需要先测量Ramp值），拉力不要过大，以保证颈部较短；第二步拉制尖端，一般要使温度低些，拉力大些。一般都是通过显微镜查看电极尖端，这很简单，并不复杂！最好是抛光，这样就在抛光仪显微镜下查看。注意抛光后的电极尖端开口会变小，故在拉制电极时，尖端开口要大些。检查电极还有其它方法，如“气泡数法”，也可用放大器通过测量电阻来查看。
2. Rm＝4πr2Rin？似乎Rin是一个用细胞大小标化的膜电阻，那为什么不用电容Cm来标化而用这个什么4πr2？细胞形状各异，Cm是个公认的膜面积的指标，电流密度不就是用Cm标化的吗？盼回答，同时希望能将Rin的意义再多讲一点，谢谢
答：（1）一定要注意不要拘泥于Rm和Rin这两个符号，文献中常混用，但实际上表示的大多是Rin。通常我们所说的“膜电阻”是指“膜输入阻抗Rin”，但也有人用来指Rm。（2）你可以用Cm来计算膜面积，实际上这也正是我们的做法，用来估算细胞大小，用于对通道电流幅度进行标化，但我们从来不用它计算膜电阻Rm（也称为“固有膜电阻”）。Rm的计算公式是数学理论上的，并没有多少应用的价值，我们很少发现有使用Rm的（虽然符号用Rm）。（3）实际上，Rin反映的当然就是膜电阻，它被称为膜输入阻抗（或膜输入电阻），也时常被称为“膜电阻”（这正是使人们产生混淆的原因！），是膜的被动反应参数之一。所谓被动反应是指膜上离子通道没有开放时，膜所表现出的电缆特性。膜的被动反应参数还包括膜电容、轴浆电阻等。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（多为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律可求出Rin。当大量离子通道开放时，膜对电流的阻力急剧降低，测试脉冲电压与通道电流之间不满足欧姆定律，无法测量Rin，也没有了测量的意义。
3. 请教什么是Channel availability？
答：Channel availability指在排除失活情况下，能够开放的某通道的多少，通过全细胞电流幅度的大小来反映。例如，海马神经元Na通道的channel availability可因乙酰胆碱M受体的激活而降低，表现为Na通道电流幅度的降低。
4. 什么是window current，我知道是激活曲线和失活曲线的重叠。但是我有一个疑问，比如电压依赖的T型钙通道，书上说在windonw current的时候有持续性的钙内流，但是T性钙通道不是有时间依赖性的失活吗？怎么会有不失活的电流呢？
答：如果将通道的稳态激活曲线与失活曲线作在一个图上，则激活曲线与失活曲线之间交叉部分的电流就是window current，在这个电压范围内，有一些通道并没有完全失活，仍能被打开，有一定的开放概率。T性钙通道是有时间依赖性的失活，但还有很小的部分失活非常缓慢，此即window current，它是一些快速失活通道的动力学特征。对于T型钙通道，其window current维持了一个紧张性去极化，对动作电位的连续发放产生影响，当然，不同细胞中的T通道其作用不尽相同。
5. 使用Clampex 8.0记录配体门控离子通道电流，protocol 如何设置?
答：需要事先在Lab Bench中设定好Channel序号和Signal名称。在Edit Protocol中选择Gap-free模式，采样频率可用5kHz，选好Input和Output。先在Clampex中启动记录（Record），然后诱发电流，可用Time Tag作诱发标记。
