| 实验步骤 | 材料与设备
鸡胗（25 个；保存于-20°C)(如，Pel-Freez,Inc.)
2-巯基乙醇（2-ME; 分子量 78.13Da; 密度 1.114)
聚丙烯烧杯（4000-ml)
匀浆器（如，BrinkmarmPolytron)
聚碳酸酯离心管（6x500-ml)
超速离心机，备有 3000-ml 体积的转头
带刻度的聚丙烯量筒（4000-ml)
粗棉布
聚丙烯漏斗（大的，宽嘴型)
试剂
缓冲液 H(10X)
(配方，见“试剂的配制”PP.82~83)
操作程序
1) 取鸡胗，室温下解冻 2 h, 然后 4°C 过夜。
2) 用手术刀除去每个胗的两叶之间的白色结缔组织，但不必担心主叶周围的少量结缔组织。弃去结缔组织，将胗切成约 1cm3 的小块。
3) 称量清理好的胗组织块，并记录重量。
4) 用蒸馏水稀释 10x 缓冲液 H 储液 f 配制成 2L1x 缓冲液 H, 每 L 加 70.1ul 2-ME, 使终浓度为 1 mmol/L 2-ME。
5) 将胗组织置 4000-ml 聚丙烯烧杯中，加人 2 倍体积（即，2 ml/g) 的1x 缓冲液 H。例如，若有 400 g 组织，则加 800 ml 缓冲液。于冷室中，将缓冲液中的组织转移至匀浆器，以接近最髙的速度匀浆三次，每次 30s。
6) 将匀浆倒入 500-ml 聚碳酸酯离心管中，用巴氏吸管平衡（匀浆相当粘稠，故需折去巴氏吸管的尖端使吸管口变大些）。于髙速离心机中，4°C，8000r/min 离心 30 min
7) 将上清倒人置有两层粗棉布的聚丙烯漏斗中，滤至带刻度的聚丙烯量筒。让上清沿量筒侧壁注人，使提取物不致产生大量泡沫（如倒啤酒不让起酒沫那样）。用刮勺将沉淀物取出，合并，放回聚丙烯烧杯。加 1 倍体积的 1X 缓冲液 H〔以原材料的原始湿重为基础（见上文第 3 步〕。重复匀浆并离心。
8) 合并第一、二次所得的上清，记录总体积。留取 0.1%(约 1 ml) 体积的上清供随后的活性测定用。你将需要知道这两个体积以作计算。 展开 |
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