农林RNA测序助力玉米籽粒Dek10突变体研究
呼吸作用是线粒体最重要的代谢。其中，线粒体中5个和呼吸相关的复合物起到了重要影响。很多呼吸链相关蛋白都是由线粒体基因组编码的。这些RNA会受到细胞核内诸如pentatricopeptide repeat (PPR) 蛋白的转录后修饰。玉米defective kernel 10(dek10) 是一个典型的籽粒变小发育迟缓的突变体。通过图位克隆发现，dek10编码了一个定位于线粒体的E族PPR蛋白。测序表明dek10突变体是由于nad3-61，nad3-62和cox2-550位点的C-U变化导致的。这些位点的变化导致Nad3显著下降，Cox2蛋白的缺失。有趣的事，复合物I并没有变化，但是NADH脱氢酶活性显著下降。复合物IV的含量显著下降。转录组测序与透射电镜（TEM）分析表明，nad3和cox2对线粒体功能密切相关。这些结果表明，E族PPR蛋白dek10对nad3和cox2的位点编辑至关重要，而这在植物发育过程中是必不可少的。
研究思路
研究结果
1 dek10导致籽粒变小以及发育迟缓
dek10-ref (dek10-N1176A)突变体来源于玉米种质中心。该突变体在获得后与W22野生型进行杂交进行背景纯化，并且表型观察。结果发现，dek10百粒重只有野生型的27%，总蛋白与胚乳重量显著下降。然而，淀粉却没有显著变化。对植株的观察发现，dek10植株的发育速度比野生型显著降低（图1）。
2 dek10的图位克隆
在植物正向遗传学中，获得突变体后往往需要对基因进行定位与克隆。在此，研究人员使用图位克隆的方法对dek10基因进行精细定位。在对947个F2代突变体种子进行鉴定后，研究人员将dek10基因定位于InDel-AC204567.28与InDel-GRMZM2G071304.4范围内。该段范围由225K个碱基组成，包含2个BAC克隆（AC204567与AC186864）。其中包含了8个可能的候选基因，根据对这8个基因的序列分析发现，GRMZM2G087226中有一段5个碱基CCTCC的插入，导致移码突变（图2）。
为了确认图位克隆的准确性，研究人员还使用了等位测试的方法对其进行了验证。结果表明，该候选基因的CRISPR/Cas9突变体与dek10的等位突变杂交后，不能使其恢复野生型表型。证实了该基因就是dek10的突变基因。
3 dek10编码了一个定位于线粒体的E族PPR蛋白
根据对dek10的进化树分析以及BLASTP分析发现，该基因编码了一个E族PPR蛋白（图3）。此外，对其进行亚细胞定位表明，该蛋白定位于线粒体。
4 Dek10对线粒体nad3-61、nad3-62与cox2-550中的RNA编辑
有文献报道，E族PPR蛋白参与了对RNA的编辑。对dek10突变体大量的线粒体转录本测序配合测序，发现了3个dek10突变体中特异的可变剪切位点：nad3 61与62以及cox2的550。导致了nad3蛋白对应氨基酸由亮氨酸转变为脯氨酸，cox2蛋白丝氨酸转变为脯氨酸（图4）。
5 dek10影响线粒体相关基因表达
为了对dek10突变对籽粒线粒体的影响有一个广泛的认识，研究人员还对dek10突变体进行了RNA测序，以期望能够获得足够的信息，了解dek10可能的具体分子机制。在此，通过RNA测序，研究人员鉴定到了48480个基因，其中包含2668个差异基因。在这些基因中，420个表现为表达量下降。其中，736个基因具有功能标注。GO富集分析后，差异基因的功能主要被归类到GO: 0005740 (Mitochondrial envelope, p-value=5.0E-18)； GO: 0015078 (Hydrogen ion transmembrane transporter activity, p-value=1.3E-13)； 与GO: 0015992 (Proton transport, p-value= 7.0E-06)上(图5）。
6 dek10影响线粒体形态
最后，研究人员为了对dek10突变后线粒体在形态上有进一步的认识，将dek10 18DAP的胚乳进行了未成熟籽粒的透射电镜观察。结果表明，dek10突变后，线粒体体积显著增大，并且呈现不规则形态（图5）。
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精英视角
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科技前沿
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项目成果
