血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-4
V 蛋白质含量测定
一、双缩脲法测定蛋白质浓度
（一）目的
了解并掌握双缩脉法测定蛋白质浓度的原理和方法。
（二）原理
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与硫酸铜形成紫色络合物，在 540nm 处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。
（三）实验仪器
容量瓶、试管、吸管、分光光度计等。
（四）实验试剂
1.标准蛋白溶液（5mg/ml） 准确称取已定氮的酪蛋白（干酪素或牛血清白蛋白）用0.05mol/l 氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。
2.双缩脲试剂：溶解1.5g 五水硫酸铜 和酒石酸钾钠于500ml 蒸馏水中，在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内，此试剂可长期保存。
3.样品血清：动物血清用水稀释10 倍，置于冰箱保存备用。
（五）操作
1．标准曲线的绘制：将7 只干燥试管编号，按下表加人试剂：
各管混匀后，分别加入双缩脲试剂3.0ml 充分混匀，于37℃水浴30min，在波长540nm处比色，以0 号管调零点测定各管吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定 取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml，置试管内，加入双缩脲试剂3.0ml充分混匀，在540nm 处测吸光度，对照标准曲线，求得未知溶液的蛋白质浓度（含量），在根据样品稀释倍数换算为g/100ml。
操作1、2 应同时进行。此外还可用标准管法测定（可参见相关资料）
二、福林-酚试剂法测定蛋白质浓度
（一）目的
熟悉并掌握福林-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。
（二）原理
蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。
此法也适用于酪氨酸或色氨酸的定量测定。
（三）实验器材
1.蛋白质及其水解产物。
2.722 型（或7220 型）分光光度计。
3.试管1.5cmx1.5cm (×8）。
4.吸管0.50ml、 0.10ml、0.20ml、5.0 ml。
（四）实验试剂
1.福林-酚试剂A ：将19 Na2CO3 溶于50ml0.lmol/lNaOH 溶液。另将0.5gCuSO4·5H2O溶于100mll％酒石酸钾（或酒石酸钠）溶液。将前者50ml 与硫酸铜-酒石酸钾溶液lml 混合。混合后的溶液一日内有效。
2.Folin-酚试剂B ：将100g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25g 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O ）、700ml
蒸馏水、50ml 85％磷酸及100ml 浓盐酸置于1500ml 磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回流10h
。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml
及液溴数滴，开口煮沸15min，驱除过量的溴（在通风橱内进行）。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液呈微绿色，贮于棕色瓶中。临用前，用标准氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂（由于试剂微绿，影响滴定终点的观察，可将试剂稀释100
倍再滴定）。根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/l 的酸（稀释1 倍左右），贮于冰箱中可长期保存。
3.卵清蛋白溶液：约1g 卵清蛋白溶于100 ml0.9%NaCI 溶液，离心，取上清液，用克氏定氮法测定其蛋白质含量。根据测定结果，用0.9
% NaCI 溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白质含量为2mg/l ，亦可用2mg/m1
的牛血清白蛋白溶液。将卵清蛋白溶液准确稀释至500ug/l。
（五）、操作
1.标准曲线的绘制
将7 支干净试管编号，按下表顺序加人试剂。混匀，室温放置10min，各管再加Folin-
酚试剂B 0.5ml，30min 后比色(500nm)，做吸光度-蛋白质浓度曲线。
Folin-酚法测定蛋白质浓度—标准曲线的绘制
2.样液测定
准确吸取样液0.5ml 置干净试管内，加入4mlFolin-酚试剂A , 10min 后，再加试剂B 0.5ml , 30min 后比色，对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。
三、紫外光吸收法测定蛋白质浓度
（一）目的
1．了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理。
2．熟悉紫外分光光度计的使用。
（二）原理
蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nln 波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。
由于核酸在280nm 波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260 处。如同时测定260nm
的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm 及260nm
的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。
（三）实验器材
1 . UV-9100 型紫外可见分光光度计
2 ．容量瓶50ml
3 ．试管
4 ．吸管0.50ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml
（四）实验试剂
1．卵清蛋白标准液：准确配制1mg/1 卵清蛋白溶液。
2．未知浓度蛋白质溶液 ：用酪蛋白配制，浓度控制在1.0 -2.5ml/l 范围内。
3. 0.9%NaCI。
