血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-3
一、试剂和器材
1．试剂
(1）消化液30％过氧化氢与硫酸与水的比例为3:2:1，即在1 份的蒸馏水中缓慢加入2 份的硫酸，待冷却后，将其加到3 份的过氧化氢中。临用时配制。
(2) 催化剂 硫酸铜（CuSO4·5H2O ）与硫酸钾（K2SO4）以1 : 3 配比研磨混合。
(3）40 ％氢氧化钠溶液 (4) 2 ％硼酸溶液
（5）标准盐酸溶液（约 0.0100mol/L) (6）混合指示剂（田氏指示剂）混合指示剂由50ml 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml 0.1％甲基红乙醇溶液混合配成。
贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且很灵敏。
2.器材
消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、电炉、100ml 锥形瓶、5ml 酸式滴定管。
一、操作方法
（一）微量凯氏定氮仪的构造和安装
凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成。蒸汽发生器包括一个电炉及一个3-5
升容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应室相连。反应室上边有二个小烧杯，一个供加样用，一个盛放碱液。样品和碱液由此可直接到反应室中。反应室中心有一长玻璃管，其上端通到反应室外层，下端靠近反应室的底部。反应室下端底部有一开口，上有橡皮管和管夹。由此放出反应废液。反应所产生的氨可通过反应室上端细管经
冷凝管通入收集瓶中。反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。安装仪器时，将蒸汽发生器垂直地固定在铁架台上，用橡皮管把蒸汽发生器、反应室、冷凝管连接起来。橡皮管连接的部位应在同一水平位置。冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准。安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。要认真检查整个装置是否漏气，以保证所测结果的准确性。
（二）样品的处理
1．固体样品 随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105℃ 的烘箱中干燥4h ，用增锅钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥lh，称重一次，恒重即可。
2．血清样品 取人血（或猪血）放入离心管中，干冰箱中放置过夜。次日离心除去血凝块，上层透明清液，即为血清。吸出lml 血清加到50ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀备用。溶液如果显浑浊，加少量氯化钠再混匀。
（三）消化
取5 支消化管并编号，在1 、2 、3 号管中各加入精确称取的干燥样品（注意：加样品时应直接送入管底，避免沾到管口和管颈上）,
加催化剂05g，混合消化液3ml ，在4 、5
号管中各加相同量的催化剂和混合消化液（若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水）作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。摇匀后，将5
支消化管放在通风厨内的远红外消煮炉上消化。先用小火加热煮沸，不久看到消化管内物质
碳化变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质丘升到消化管的颈部，否则将严重地影响样品测定结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化碳也均匀地放出时，适当加强火力。在消化时，应使全部样品都浸泡在消化液中，如在瓶颈t
发现有黑色颗粒，应小心地将消化管倾斜振摇，用消化液将它冲洗下来。通常消化需要1-3h（对于那些赖氨酸含量较高的样品需要更长的时间）。待消化液变成褐色后，为了加速消化完成，可将消化管取出，稍冷，加30％过氧化氢溶液1-2
滴于管底消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即告成功。为了保证消化彻底，再继续加热0.5h
。消化完毕，取出消化管冷却至室温。
（四）蒸馏
1．仪器的洗涤
仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器（正在测定中的仪器）加样前使蒸汽通过1-2min
即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸一指示剂混合液中指示剂的颜色合格为止。洗涤方法如下：取2-3 个100ml
锥形瓶，加入10m1 2％硼酸、2 滴混合指示剂，用表面皿覆盖备用。先煮沸蒸汽发生器，器中盛有2/3
体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，样品杯中也加入2/ 3
体积蒸馏水进行水封。关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出。在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴。这样用蒸汽洗涤5min
左右，在冷
凝管下口放一个准备好的盛有硼酸-指示剂的锥形瓶，位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于液体内，继续用蒸汽洗涤 1-2 min
，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，若不变色，则证明蒸馏器内部已洗涤干净。下移锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约 1cm ，继续通蒸汽 lmin
。最后用蒸馏水冲洗冷凝管外口，排废开始。用右手轻提样品杯中棒状玻塞，使水流入反应室的同时，立即用左手关闭夹子，盖好玻塞。由于反应室外层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中插管自动抽到反应室外壳中，再在样品杯中加入
2 / 3 体积蒸馏水，如此反复三次即可排尽废液及洗涤液。打开夹子将反应室外壳中积存的废液排出，关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪 1-3min
，可进行下一次蒸馏。
2．样品及空白的蒸馏 取5 个100ml 锥形瓶，分别加入2％硼酸 10ml ，混合指示剂2
滴，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。把消化管中的消化液全部转移到样品杯中，用约2ml 蒸馏水冲洗消化管，重复 3
次，把洗涤液都倒入样品杯中，打开样品杯的棒状玻塞，将样品放入反应室，用少量燕溜水冲洗样品杯后也使之流入反应室，盖上玻塞，并在样品杯中加约2/3
体积的蒸馏水进行水封。而后将装有硼酸一指示剂的锥形瓶放在冷
凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，放
10ml40％氢氧化钠溶液于反应室后，立即上提锥形瓶，使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下。反应液沸腾后，锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由紫红色变为绿色，自变色时起计时，蒸馏
3-5min，移动锥形瓶，使硼酸液面离开约1cm
，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口外面，继续蒸馏lmin，将锥形瓶取出，用表面皿覆盖以待滴定。排废和洗涤等操作与前面相同。排废洗涤后，可进行下一个样品的蒸馏（每一个样品要同时做三份，以求得准确结果）。待样品和空白消化液蒸馏完毕后，同时进行滴定。
（五）滴定
全部蒸馏完毕后，用 0.0100mol/I 标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。
（六）计算
样品的总氮含量（g 氮/%）= ( A-B )×0.0100×14×100/ (C×1000)
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，（如血清）则：
样品中的蛋白含量（g / % ) = ( A-B )×0.0100×14×6.25×100/ (C×1000)式中： A
为滴定样品用去的盐酸体积（ml ) ; B 为滴定空白用去的盐酸体积（ml ) ; C为称量样品的量（g ) ; 0 . 0100
为盐酸的摩尔浓度（ mol/l ) （实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写） ; 14 为氮原子量；6.25 为系数（1
ml0.01mol / I 盐酸相当于0.14mg
氮）。若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5 %
，然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。
蛋白氮＝总氮-非蛋白氮蛋白质含量（g/％) ＝蛋白氮×6.25
IV 透析
原理：透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸或称塞璐玢纸、火棉纸或称塞璐锭纸盒其他改型的纤维素材料，透析时把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降低到最小值为止。
一、试剂和器材
1．试剂
EDTA，NaCO3，NaOH。
2．器材
电炉，磁力搅拌器，500ml 烧杯
二、操作过程
1．透析袋的预处理：取100ml 0.01mol/l 的EDTA 溶液，加入1gNaCO3，溶解后用NaOH 调pH
值为7.0；将透析袋剪成适宜长度，放入EDTA 溶液中煮沸10 分钟，然后用蒸馏水冲洗，再用EDTA 溶液煮10 分钟，反复处理4-5
次，在蒸馏水中与4℃保存备用。
2．透析：将样品放入透析袋内，两端封闭（注意袋内不要留气泡），放入透析液中在磁力搅拌器上透析。
