血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-2
二、组织样品
在生化实验中，经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。或者从组织中分离、纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。
但是，在生物组织中，因含有大量的催化活性物质，离体组织的采集必需在冰冷条件下进行，并日需尽快完成测定。否则其所含物质的量和生物活性都将发生变化。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出所需脏器或组织，除去脂肪和结缔组织，用冰冷生理盐水洗去血液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。
组织糜：迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或加入少量砂于乳钵中，研磨至糊状。组织匀浆：取一定量新鲜组织剪碎，加入适量匀浆制备液，用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨碎组织。由于匀浆器的柞头在高速运转中会产生热量，因此在制备匀浆时，需将匀浆器置于冰水中。
常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和0 .25mol/L 的蔗糖液等，可根据实验的要求，加以选择。
组织浸出液：上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。
II 蛋白质的沉淀反应
1．实验原理
在水溶液中，蛋白质分子表面结合大量的水分子，形成水化膜，同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。当某些物理化学因素导致蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，甚至变性时，它就丧失了稳定因素，以固态形式从溶液中析出，这就是蛋白质的沉淀作用。蛋白质的沉淀作用分为两类：
1）可逆沉淀作用
在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。属于此类的有盐析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀。盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺。同时蛋白
质分子所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
有机溶剂沉淀蛋白质：在蛋白质溶液中加入适量丙酮或乙醇，蛋白质分子的水化膜被破坏而沉淀。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
2）不可逆沉淀作用
一些物理化学因素往往会导致蛋白质分子结构，尤其是空间结构破坏，因而失去其原来的性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。重金属盐，生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉定：重金属盐类Cu2+、Ag+、Pb2+和Hg2+等均能与蛋白质分子中的巯基等基团结合，生成不溶物而沉淀。生物碱试剂与蛋白质结合形成不溶物，使蛋白质沉淀。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。
2．试剂和器材
1）试剂
(1）蛋白质氯化钠溶液 取20ml 蛋清，加蒸馏水200ml 和饱和氯化钠溶液l00ml ，充分搅匀后纱布滤去不溶物。（加氯化钠的目的是溶解球蛋白）。
(2）蛋白质溶液 取5ml 蛋清，用蒸馏水稀释至100ml ，搅拌均匀后，用纱布过滤。
(3）饱和硫酸铵溶液 称固体（NH4）2SO4 加于l000ml 蒸馏水中，在70-80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铁溶液。
(4）饱和苦味酸溶液 取2g 苦味酸放入三角烧瓶，加蒸馏水100ml，80℃ 水浴约10min 使之完全溶解，于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶，上清液即为饱和苦味酸，此液可存放数年。
(5) 1 ％醋酸铅溶液
(6) 1 ％硫酸铜溶液
(7) 1 ％三氯乙酸溶液
(8) 0.5％磺基水杨酸溶液
(9) 1％醋酸溶液
(10) 5％鞣酸溶液
(11）硫酸铵粉末
2）器材
试管及试管架，抽滤瓶、量筒、布氏漏斗等
3．操作方法
1）蛋白质的盐析作用
取1 支试管加入3ml 蛋白质溶液和3ml 饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解达到饱和为止析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。
2）乙醇沉淀蛋白质
取1 支试管加蛋白质溶液lml ，加晶体氯化钠少许（加速沉淀并使沉淀完全）待溶解后再加95%乙醇2ml 混匀，观察有无沉淀析出。
3）有机酸沉淀蛋白质
取2 支试管，各加入蛋白质溶液约0.5ml ，然后分别滴加10%三氯乙酸和0.5％磺基水杨酸数滴。观察蛋白质沉淀。
4）重金属盐沉淀蛋白质
取 2 支试管各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1％醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。
5）生物碱试剂沉淀蛋白质
取2 支试管各加蛋白质溶液2ml，及1%醋酸4-5 滴，其中一管滴加5%鞣酸，另一管滴加饱和的苦味酸溶液，观察沉淀的形成。
III 总氮量的测定一微量凯氏定氮法
常用微量凯氏定氮法测定天然含氮有机物中的含氮量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氨进一步与硫酸作用生成硫酸铁。由大分子分解成小分子的过程通常称为“消化”。消化过程一般进行的比较缓慢。通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点（消化液的沸点由290℃-400℃
），加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。
硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H＋浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H＋浓度为止。最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。
( NH4 ) 2SO4＋2NaOH →2NH4OH + Na2SO4
NH4OH→NH3 + H2O
H3BO4 → H + + H2BO4
NH3 + H+＋H2BO4- → NH4H2BO4
NH4H2BO4+ HCI → NH4CI + H＋+H2BO4-
