琼脂糖凝胶电泳实验
【实验目的】
学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术。
【实验原理】
琼脂糖凝胶电泳技术是DNA 分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA 分离纯化的重要实验手段。DNA 分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA 带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA 分子本身的大小和构型。DNA 分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA 分子也可以通过这种方法进行分离。
溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm 的红色荧光，DNA 分子与EB 形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用来观察凝胶中DNA 条带的位置。
【仪器、材料与试剂】
琼脂糖凝胶(0.7～1.5%，琼脂糖粉末与1×TAE 配成)，TAE(Tris-乙酸盐，EDTA)电泳缓冲液[50×浓缩贮存液：Tris 碱242g；冰醋酸57.1mL；0.5 mol/L EDTA (pH8.0)，100mL；加600mL、蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至1000mL，浓盐酸调pH 至8.0]。
2.溴化乙锭(EB)贮存液(10mg/mL)：在100mLH2O中加入1g溴化乙锭用磁力搅拌器搅拌几个小时，然后转至棕色瓶中，4℃贮存(溴化乙锭是强诱变剂，称量时需要戴手套和口罩，万一接触了溴化乙锭，立即用大量的水冲洗)。
3.10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、15%的 Ficoll水溶液、0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0、1.0%SDS。
4.刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、紫外分析仪、数码相机、封口胶带和电源等。
【实验步骤】
用封口胶带封住塑料托盘开放的两边或清洁干燥的玻璃板的边缘形成一个模具(仅靠用手指沿平板边缘来回抹几次，使胶布紧密封住粘缝就可以了)，置一个水平台上。
2.根据被分离DNA 片段的大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉将其加入到盛有已定量电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中，用玻璃棒搅拌均匀后放入沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化。
3.琼脂糖溶液正在冷却时，用合适的样品梳形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5～1.0mm。
4. 待凝胶稍微冷却后，将胶缓慢倒入已用胶带封好的模具中，胶厚度以3～5mm 为宜。
5.让凝胶溶液完全凝结，室温下30～45min，待胶略凝结时放入4℃冰箱可大大缩短凝结时间。小心拔出梳子，轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极(黑末端)。
6.向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。
7.取适量的DNA 样品与10×加样缓冲液混合(分析单一DNA 样品，如L 噬菌体或质粒DNA，每个5mm宽加样孔可加100～500ngDNA。如果样品由不同大小的许多DNA片段组成，如哺乳动物DNA 酶切样品，则每个加样孔加入20～30μg 的DNA 也不会造成分辨率明显下降)，然后用移液枪将样品加入样品孔内。一定要包含合适的DNA 分子量标准物，将其分别加至样品孔的左侧和右侧孔中。
8.加样完毕后，关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA 应向阳极(红色插头)侧泳动。
给予1～5V/cm 的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。若电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡。
9.电泳时间的选择取决于胶的长度、电压和DNA 片段的大小。胶越长，电压越低，DNA 片段越大，所需时间就越长。然而使用高压时，大的DNA 片段的分辨率很低，电泳出的条带不清晰。
10.当DNA 样品在凝胶中迁移足够距离时，关上电源并取出样品放入事先配好的EB 溶液中染色5～7min(EB 见光分解，应置于暗室中)，在紫外分析仪上观察并可用数码相机进行拍摄。
【注意事项】
注意溴化乙锭 (EB)是一种强诱变剂，有致癌嫌疑，操作过程戴手套和口罩，并注意把实验中沾染EB 和未沾染EB 的实验器具分开，防止EB 交叉污染！
2. 配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，严重影响DNA 片段的泳动。 3.微波炉加热时间过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。应调整好加热所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。
4.溴酚蓝与0.5kb 大小的DNA 的泳动度相近，这可给泳动最快的DNA 片段提供一个指示。
5.凝胶要用于印迹分析或将要回收DNA 条带时，每个样品必须使用一个新的枪头。
6.影响DNA 的迁移率的因素：
1)DNA 分子大小：DNA 分子越小，迁移越快。
2)DNA 分子构象：共价闭环DNA>线形DNA>开环双链DNA。
3)琼脂糖浓度：其浓度越低，迁移越快。
4)两极间电压：电压越高，迁移越快。
7.DNA 区带不清晰，有可能是点样量少或过大，但也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂的原因。
8.为了消除 RNA的影响，可以在电泳前加RNA酶(约每10μL DNA加1μL RNA酶)，37℃水浴30min。
9.在进行电泳的过程中，溴酚蓝有可能会变黄，这是由于电泳液使用过久或残留在电泳液中的凝胶变质引起DNA 结构改变或丢失。时常更换电泳液和刷洗电泳槽即可。
