目的基因的获取-1
基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。这类基因称之为目的基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
目前目的基因的获取方法主要有以下2类：
（1）已知基因的获得：PCR分离法和化学合成法等
（2）未知基因的获得：直接分离法和基因文库分离法等
第一节 直接分离法
1、限制性内切酶法
用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
应用对象：适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少，获得也比较简单。
（1）对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。
（2）对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。
（3）即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。
2. 随机片断化
2.1. 限制性内切酶局部消化法
控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
2.2 机械切割法
（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。
（2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
3. 物理化学法
基本原理：DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、AT间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。
3.1密度梯度离心法
由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大，利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分离开来。然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。非洲爪瞻5SDNA和海胆组蛋白基因就是根据此分离得到。
3.2单链酶解法
DNA分子中某基因片段GC碱基含量高，则其热稳定性高，即其解链温度（Tm）值就高。据此，可以通过控制解链温度使富A=T区变性解链，而富G≡C区的DNA的片段。海胆rDNA分子内GC含量可高达63%，通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA。
3.3 分子杂交法
单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，这是分子杂交的原理。1969年，美国哈佛大学Beckwith等应用DNA-DNA分子杂交，成功分离了b-半乳糖苷酶基因。
第二节 PCR分离法
如果知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与引物互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。摸板可以是基因组DNA，也可以是mRNA序列，或是已克隆到某一载体上的基因片段。
与直接分离获得目的基因相比，采用PCR分离目的基因省时、省力，但他一般要求待扩增的片段是已知的，至少要求DNA片段两端长约20bp的序列已知的，这样才能设计出有效的引物。但利用常规的PCR合成的片段一般在1kb以内。
PCR反应过程：
①变性。这是PCR反应的第一步，即将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；
②退火。将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；
③延伸。将反应体系温度调整到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。
如果大量扩增未知序列的特异DNA片段，或是更长的DNA片段，则需选择特殊类型的PCR策略。如套式PCR、反向PCR、不对称PCR、锚定PCR等。
第三节构建基因文库分离法
（一）基因文库
1. 概念
基因文库（gene library）是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA
片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑）（或成活细胞）即为一个DNA
片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。
2、意义
（1）使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来
（2）是分离克隆目的基因的主要途径
（3）复杂基因组作图的重要依据。
3、构建
基因文库构建的一般步骤：（1）细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；（2）载体DNA的制备；（3）载体与外源大片段连接；（4）体外包装及基因组DNA文库的扩增；（5）重组DNA的筛选和鉴定。构建过程如下：
图1 基因组文库构建的概况
举例：
图2 采用λ噬菌体载体EMBL3A产生基因组DNA文库。高相对分子质量的基因组DNA由Sau3A I部分地消化。得到的片段用磷酸酶处理，以去除它们5’端的磷酸基团。载体由BamH I和EcoR I消化，它们在多位点接头内切割。微小的BamH I／EcoR I多位点接头的片段在异丙醇沉淀中除去，或者还可以通过预先的琼脂糖凝胶电泳纯化载体的臂。接着载体臂和经过部分消化的基因组DNA相连接。磷酸酶的处理可以防止基因组DNA片段自相连接。非重组载体不能重新复原，因为那些小小的多位点接头片段已去除。仅有的装配分子则是重组噬菌体。它们是作为Sup+大肠杆菌的P2溶源菌的噬菌斑获得的。Spi-筛选确保了缺乏red和gam基因的噬菌体的复原。Sup+宿主是必要的，因为在这个例子中，载体在基因A和B上带有琥珀突变。这种突变增加了生物保守性，可以用于筛选的程序(比如重组筛选)，或Sup+基因的DNA标记。最终，外源的DNA通过SalI位点从载体上切除[注意：Roger：等(1988)已经发现EMBL3多克隆为单序列并非完全像以前描述的那样。它包括一段特别的序列，上面有一个以前没有报告过的Pst I位点。但这不会影响到载体的大多数功能
