目的基因的获取-4
4、cDNA文库的大小
一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。
p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%）
1/n: 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例
N：所需的重组载体数（克隆数）
(三)基因组文库与cDNA文库的区别
1. cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在：
（1）cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通过DNA中间体，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。
（2）cDNA基因文库的筛选比较简单易行。
（3）由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低，而相比之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。
（4）cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。
原因是：高等真核生物与原核生物在结构组成上的最大区别是前者含有内含子间隔序列，而后者没有。通过基因文库中筛选的目的基因难以在原核生物中表达。而cDNA是经过转录后得来的其内含子部分已被删除。
（5）cDNA克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究
种特异的mRNA在细胞中往往占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。一般是通过比较基因组进行确定
2. cDNA文库与基因组文库相比的缺点
（1）受材料来源的影响：
（2）遗传信息量有限：
①文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该植物在某一特定发育时期，某一特定组织（或器官）在某种环境条件下的基因表达情况，并不能包括该植物有机体的全部基因。在某种意义上讲它可以表现基因组的功能信息。
②cDNA文库只反映mRNA的分子结构。cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因。
（3）构建的cDNA文库中高丰度的（含量） mRNA含量比低丰度的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而低丰度的很少
(四)克隆的鉴定方法
要鉴定DNA文库中的一个特殊克隆，可以通过克隆的序列和其表达产物的结构功能来进行的。前者可用于任何类型的文库、基因组或cDNA，它包括核酸杂交和PCR。无论哪种情况，探针或引物的设计都可用于一个特殊的克隆或者一系列结构相关的克隆。注意，PCR筛选也可用于从未克隆的基因组DNA和cDNA中分离DNA序列。对克隆产物的筛选仅用于表达文库，例如DNA片段可用于表达一个蛋白质的文库。在此情况下，克隆可得到鉴定，因为其产物可由一些自然的抗体或配基来确定，或者因为保持了蛋白质的生物活性，而可由适当的检验系统来检测。
筛选目的克隆最常用的方法是探针杂交法。
探针是由目的基因的已知的信息决定的，有三种可能性：
1） 目的基因在特定细胞中的丰度
2） 基因所编码的蛋白质或者部分序列
3） 基因是一个基因家族中的一个
举例： 利用同源探针筛选目的克隆
任意的两条单链核酸分子都有可能通过碱基配对结合，大部分的配对分子是不稳定的，因为只有少量的碱基配对。然而如果两条链是互补的，大部分碱基可以配对形成稳定的分子。不仅DNA间可以配对，DNA 与RNA间也可以进行配对。因此可以使用同源探针筛选目的克隆。
如果克隆的基因所编码的蛋白已知。就可以利用遗传密码子预测相关基因的核苷酸序列，只有蛋氨酸和色氨酸无兼并密码，其他的氨基酸至少有两种密码子。例如丙氨酸有四种密码子，前两位是相同的，GCA,GCT,GCC,GCG，只能正确的预测两位的碱基。
例如细胞色素C，从59号氨基酸的一段序列：Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met，相应的DNA序列是TGG-GA(T/C)-GA(A/G)-AA(T/C)-AA(T/C)-ATG，在18个碱基中有14个是可以预测的。如果用来杂交的18核苷酸的序列有上千种可能的排列，很显然不适合于合成探针。
利用同源探针克隆基因
第四节 化学合成
1976年H.G.
Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。化学法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。在基因的化学合成中，通常是先合成一定长度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。其中，全自动合成仪化学合成DNA采用效率极高的是固相亚磷酸三酯法。
固相亚磷酸三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA的合成，其合成方向是由引物的3′末端向5′端合成，相邻核苷酸通过3′—5′端磷酸二酯键连接。其过程为：（1）将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；（2）合成DNA的原料（亚磷酰胺保护的核苷酸单体）与活化剂四氮唑混合，得到反应活性很高的核苷亚磷酸活化中间体（其3′端被活化，5′-羟基的仍然被DMT保护），与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；（3）带帽反应，缩合反应中可能极少数5′-羟基没有参加反应，带帽反应中使用乙酸酐和1-甲基咪唑使这些核苷5′-羟基反应形成酰，终止其继续发生反应而成为短片段，这种短片段在纯化时分离掉；（3）缩合后在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
目前，化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150-200bp，而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。
常用的基因组装方法主要有两种：
第一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的5’-磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。
第二种方法是将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上。
