蛋白质间相互作用研究方法3：BIAcore
快速分析过去已确定的相互作用
l 利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质
RAMc通过伯氨基与CM-5传感芯片表面的结合
1．将CM-5传感芯片模块嵌入BIAcore仪器。
2．全部采用过滤并除气的HEPES缓冲盐溶液。
3．将分别含有NHS、EDC、乙醇胺和RAM Fc以及20 mmol/L HCl各100μl的小管置于BIAcore自动进样器架的适当位置。
4．将一个空管置于BIAcore自动进样器架上。
5．开动仪器，以5μl/min的流速流过一个流动池。
6．将75μl的NHS加入到一个空管中。
7．在同一个管中再加入75μl的EDC。
8．将含有NHS和EDC的小管中的成分混匀。
9．注射35μl NHS/EDC混合物使表面活化。
10． 注射35μlRAM Fc到活化表面与抗体结合。
11． 注射35μl乙醇胺使过量的反应基团失活。
12． 快速注射10μl的20 mmol/L HCL，然后用Extraclean除去非共价结合型材料。
13． 通过在开始注射RAMc前放置一个基线报道点，并在注射20 mmol/L HCl结束后2 min放置第二个报道点，来测定结合RAMc水平。
14． 关闭流动液，关闭命令窗口，保存报道文件。
检测抗-TSH与RAMc表面的结合
15． 开动仪器，使含有结合RAMc的流动池流速为10μl/min。
16． 注射10μl的2μg/ml抗-TSH。
17． 快速注射10μl的20mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。
18． 为了测定结合到RAMc表面的重现性，用可以与抗TSH结合引起250 Rus所需的体积重复注射抗TSH。
19． 快速注射10μl的20 mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。
20． 关闭流动液体，关闭命令窗口，保存报道文件。
检测TSH与捕获抗-TSH表面的结合
21． 开动仪器，使含有结合RAMc的流动池的流速为10μl/min。
22． 注射10μl的2μg/ml抗-TSH。
23． 注射25μl的200 nmol/L TSH，限定120 s的解离时间。
24． 快速注射10μl的20 mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。
25． 关闭流动流，关闭命令窗口，保存报道文件。
