神经内分泌肽能系统干扰中的蛋白质组学分析实验
环境污染物可以影响许多胞内酶活性。酶抑制因子对蛋白质组的影响可以利用双向电泳来确定。在神经内分泌细胞中，前体蛋白转化酶 1 和 2 (proprotein convertase 1 和2, P C l 和 PC2 ) 介导许多蛋白质前体水解为肽激素和神经肽。这些钙离子依赖的蛋白酶的活性可以被环境中的螯合剂和重金属离子调节。这种抑制可以导致潜在的肽能系统的病理性破坏。我们想要知道这些酶的特异性的抑制在何种程度上可以影响神经内分泌细胞的蛋白质组。为了解决这个问题，我们采用鼠脑垂体 AtT2 0 细胞作为模型。我们比较
| 实验步骤 | 一、材料1 细胞培养和裂解（1）小鼠脑垂体 AtT20 和 AtT20 (proSAAS) 细胞系。 AtT20 .(proSAAS) 细胞系通过用包含一个新霉素抗性基因的 proSAAS 表达载体转染 AtT2 0 细胞，再利用该基因对细胞毒性药物 G4 1 8 的抗性挑选阳性细胞得到（11)。 （2）含有 1 0 % 胎 牛 血 清（Wisent Inc. ， Quebec, Canada) 和 30 pg/m L 硫酸双生霉素的 DMEM 培 养 基（Gibco/BLR, Grandlsland, N Y)，含或不含 500 pg/mL的 G418 (Gibco/BLR)。 （3）磷 酸 盐 缓 冲 盐 溶 液（PBS): 1. 35 mol/L 的 NaCU 28 mmol/L 的 KC1， 80mmol/L 的 Na2 HPO4 • 7 H20 ， 15 mmol/L 的 KH2PO4， pH 7. 2。 （4）Versine: 含 0.I mmol/L EDTA 的 PBS。 （5）缓 冲 液 B: 10 mmol/L 羟 乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸（HEPES) -KOH， pH 7.4， 10mmol/L KC1, I.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol,』L EGTA 钠 ， I mmol/L 二硫苏 （6）蛋 白 酶 抑 制 剂（ PIC) 片 剂（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany): 一片 溶 于 10 m L 缓 冲 液 B （7）Corning 细 胞 刮 刀（Sigma-Aldrich, St Louise, MO)。 （8）注 射 器（3 mL) 和 针 头（2 6 目）。 （9） 蛋白质浓度测定试剂盒（Bio-Rad, Hercules, CA)。 2 双向凝胶电泳（1）IPGphor 胶条槽， 18 cm (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ)。 （2）IPGphor 等电聚焦系统（Amersham Biosciences)。 （3）Hoeffer DALT 电泳系统（Amersham Biosciences)。 （4） pH 4〜7L 的固相 pH 梯 度（IPG) 胶条， 18 cm (Amersham Biosciences， Uppsala， Sweden)。 保存于一 20°C 。 （5）水 化 上 样 缓 冲 液（RB) : 7 m o l/L 尿 素 ， 2 m o l/L 硫 脲 ， 4 % CHAPS,1 % DTT （6）BiaLyte 3/10 两性电解质（Bio^Rad)。保存于 4°C 。 （7）矿 物 油（Bio——Rad)。 （8）IPG 胶条平衡缓冲液（EBl): 50 mmol/LTris-HCl， pH 8.8, 6 mol/L 尿素，30% (V/V) 甘油， 2 % 十二烷基磺酸钠（SDS)， 1 % DTT, 1X 10-4% 溴酚蓝。 （9）IPG 胶条平衡缓冲液（EB2): 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.8, 6 mol/L 尿素，3 0 % (V/V ) 甘油， 2 % SDS， 4 % 碘乙酰胺， 1X 10-4% 溴酚蓝。 （10） 甲叉双丙烯酰胺溶液（30_8%T ) (神经毒，戴手套!）： 3 0 % 丙烯酰胺， 0.8% （11）1 0 % SDS。 （12）1 0 % 过硫酸胺。 （13） 四甲基乙二胺（TEMED， BitRad)。 （14） SDS 电泳缓冲液： 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 0.1% SDS。 （15）低熔点琼脂糖（LMT) (Gibco/BLR)。通过微波炉加热溶解 1 % L M T 至 SDS电泳缓冲液中。在使用前保持 50°C 。 （16）银染溶液：a固定液： 3 0 % 乙醇， 5 % 乙酸；b 敏化液： 0.02% 硫代硫酸钠；c银染试剂： 0 . 2 % 硝酸银。d 显影液： 4 % 碳酸钾， 0.025% 甲醛(37%); e 停显试剂： 4 % Tris 碱 ， 2 % 乙酸。 （17）Umax Powerlook 1100 扫 描 仪（Umax Technologies, Dallas, TX)。 3 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS)（1）胰蛋 白 酶（cat.no. V5111， Promega, Madison， WI)。 （2）ZipTip (：18 移 液 吸 头（Millipore， Bedford, MA)。 （3） 基质溶液： 10 m g/m L 的 a-氰-4-羟基肉桂酸溶于含〇.1% 三氟乙酸的 50% 乙腈。 （4）Voyager DETm-P R O 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 - 飞 行 时 间 质 谱（MALDI-TOF)(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)。 （5）MALDI 板（PerSeptive Biosystems， Framingham, MA)。 4 免疫印迹（1） 硝酸纤维素膜（Bio-Rad)。 （2）Towbin 缓冲液： 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 0.1% SDS， 2 0 % (V/V) 甲醇。 （3）IX T ris 缓 冲 盐 溶 液（1XTBS): 10 mmol/L Tris-. HCl， pH 8_0， 150 mmol/L NaCl （4） TBS——T : I X TBS, 0.1% Tween-20。 （5）5 % 脱脂牛奶溶液： TBS^T , 5 % 脱脂牛奶。 （6）ECL™ 抗兔抗体，辣根过氧化物酶链接的 F Ub’)2 片 段（来自驴）（ AmershamBiosciences)„ （7）Western Lightning 化学发光试剂（PerkinElmer, Boston, MA)。 二、方法1 样本制备（1）将 AtT2 0 和 AtT20 (proSAAS) 细 胞 用 150 m m 的 培 养 皿 培 养（每 种 细 胞 3盘），加 人 DMEM，在 37°C ， 5 % C0 2- 9 5 % 空 气 的 润 湿 环 境 中 生 长 至 满 。AtT20 (proSAAS) 的培养基添加了 500fxg/mL 的 G418。 （2）每次用 10 m L 的 PBS 漂洗单层细胞 3 次。 （3）用 Versine 覆盖细胞；用细胞刮刀将细胞从板上刮下，将细胞悬液转移到离心管中。 （4）4°C 1300 g 离心 5 min 沉淀细胞。移出并丢弃上清液。 （5）如上所述再次离心来移去残留的 Versine。 （6）用 0.5 mL 的含 PIC 的缓冲液 B 重悬细胞，用带有 2 6 目针头的注射器推拉 3 0 次来破裂细胞。 （7）将裂解产物 4°C , IOOOg 离 心 7 min。将上清液转移到新管子中并丢弃沉淀。 （8） 4°C 下 l 〇 V 离心上清 30 min，将 上 清 液（细胞质成分）转移到新的管子中并保 （9）加 3 倍体积的丙酮到每份细胞质成分中并置于一 20°C lh ，沉淀蛋白质。 4°C 下15 800 g离 心 15min 。弃去上清液，保留沉淀。 （10）用超声处理法将每份细胞质沉淀或微粒体蛋白溶于 500 的 R B 中（见注释1) （11）使用 Bio——Rad 蛋白质浓度测定试剂盒， Bradford 法确定蛋白质浓度。 2 双向电泳2.1 等 电 聚 焦（IEF)
2.2 十 二 烷 基 磺 酸 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 肢 电 泳（SDS^P A G E )
3 银 染（19)3.1 银 染（见 注 释 7) 以下步骤在振荡中进行。 (2)更换固定液再振荡 30 min。 (3)用水漂洗凝胶 5 次 ，每 次 5 min。 (4)在敏化液中孵育凝胶 lmin。 (5)用水漂洗凝胶 2 次 ，每 次 lmin。 (6)在银染试剂中孵育凝胶 30 min。 (7)用水漂洗凝胶 2 次 ，每 次 lmin。 （8）在显影液中孵育凝胶直到蛋白质斑点出现。 （9）用停显试剂终止显影 30 min。 （10） 用水漂洗凝胶 3 次，每 次 5 min。 3.2 2D 图像获取 银染凝胶在 Umax Powerlook 1100 扫 描 仪（图 1 ) 上扫描，保存数子图像。 4 银染胶脱色 （20)（1）切取感兴趣的凝胶斑点。 （2）按 1 : 1 的比例混合 30 mmol/L 的铁氰化钾和 100 mmol/L 的硫代硫酸納。 （3） 用 100 uL 以上溶液覆盖凝胶片。 （4） 室温下振荡直到银染去除。 （5） 每次用 500 uL 水漂洗凝胶片，并更换水数次直到黄色试剂去除。 （6） 在 200 uL 200 mmol/L 的碳酸氢氨中孵育凝胶片 20 min 并振荡。 （7）用 500 水漂洗凝胶片 2 次 ，每 次 lmin。 （8）离心并除去水。 5 胰 酶 消 化 （21， 22)(1)将凝胶片在 200 uL CH3CN 中孵育 10 min。 (2)离心并除去 CH3CN。 (3)SpeedVac 真空离心蒸发浓缩凝胶片 15 min。 (4)56°C 下在 100 )nL 100 mmol/L NH4 HCO3, 10 mmol/L DTT 中孵育凝胶片45 min (5)离心并除去 D T T 溶液 (6)加 100 100 mmol/L NH4 HCO3， 55 mpol/L 碘乙酰胺，并在室温下黑暗中孵 育 30 min。 (7） 离心并除去碘乙酰胺溶液。 (8)在 100 100 mmol/L NH4 HCO3 中振荡漂洗凝胶片 lOmin。 (9) 离心并除去 NH4 HCCV 溶液。 (10) 室温下在 100 pL CH3C N 中脱水凝胶片 5 min。 (11) 离心并除去 CH3CN (12)在 100 uL 100 mmol/L NH4 HCO3 中振荡漂洗凝胶片 5 min。 (13)离心并除去 NH4 HCO3 溶液。 (14)室温下在 100 uL CH3CN 中脱水凝胶片 5 min。 (15)离心并除去 CH3CN。 (16)SpeedVac 真空离心蒸发浓缩凝胶片 15 min。 (17)在冰上用 20 含 500 ng 胰酶的 50 mmol/L NH4 HCO3 泡胀凝胶片 30 min。 (18)去除残留的胰酶溶液，并 加 50 mmol/L 无胰酶的 NH4 HCO3 覆盖凝胶片。 (19)37°C 下消化凝胶中的蛋白质过夜。 (20)离心并将上清转移到新會子中。 (21)加 50 uL 50% C H 3 C N , 0 . 1 % 三氟乙酸到凝胶片上并在冷水浴中超声处理 3 min。 (22)离心并转移上清到最初的上清中。 (23)再重复步骤 2 1 和 22 两次。 (24）SpeedVac 真空离心蒸发浓缩上清液直到体积小于 10 uL。 (25）加0 . 1 % 三 氟 乙酸至 10 uL 。 6 胰蛋白酶肽段 MALDI-TOF 质谱分析（1）在 MALDI-TO F 分析之前，按照制造商说明书用 ZipTip C18 移液吸头纯化胰蛋白酶消化的肽段。 （2）将纯化的肽段用 2 uL 基质点在 M A L D I 板上。 （3）用以下仪器设定采用延迟提取和反射模式进行质谱分析： 20 k V 加速电压， 150ns 延迟时间， 7 0 % 栅极电压， 0.05% 导向线电压， 128 激光发射，激光强度2000, 质量门从 800 到 2800。m/z 842. 5 1 和 m/z 1045. 5 6 的胰酶自降解产物用于 内部质量校准（图 2)。 （4）选择单同位素峰的质量，通过使用搜索引擎 PeptIdent (http://www.expasy.ch/tools/peptident.html) 搜索 Swiss-Prot 和 TrEMBL 数据库，与相应理论质量匹配在 50 ppm® 之内来鉴定蛋白质。 7 2D 免疫印迹（1）如 3. 2 所述重复制备 2D 凝胶。 （2）根据制造商用户手册，在 含 Towbm 缓冲液的 Hoefer SE 600 槽中将蛋白质点从未染色的凝胶上转移到硝酸纤维素膜上。 （3）用 5% 脱脂牛奶溶液封闭膜。 （4）室温下将膜在含抗-EphA2 —抗 的 5 ¼ 脱脂牛奶中孵育 lh 。 （5）在 TBS”T 中漂洗膜 4 次 ，每 次 5 min。 （6） 在 含 HRP-结合的驴抗兔 IgG 的抗体的脱脂牛奶溶液中孵育膜 lh 。 （7）在 T B S T 中漂洗膜 4 次，每 次 5 min。 （8） 根据制造商方案，用 Western Lightning 化学发光试剂显示免疫反应斑点（图3)。 |
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| 注意事项 | （1） 样品蛋白的完全增溶、去解聚、变性和还原是用 2D 凝胶分离蛋白质能否成功的关键。因此，蛋白质沉淀需在 R B 中用超声处理至少 3 min 以溶解。因为尿素在较高温度下可以降解为异腈酸盐，导致蛋白质氨甲基化，所以超声处理在冰水浴冷却下用 cuphorn 超声仪进行。 （2）IPG 胶条槽是用陶瓷制成的，使用时小心。 （3）为了避免污染，带手套工作。不要让 IPG 胶条下存留气泡。 （4） 这 里 用 来 制 备 溶 液 的 水 必 须 拥 有 以 上 的 电 阻 率 。 （5）20 cm 长带盖子的玻璃管用于平衡很理想。 （6）避免在 IPG 胶条和 SDS 胶之间存留气泡。 （7）银染是最敏感的可视化方法。为得到高质量的结果，应使用高纯度的试剂并戴手套以避免污染。 |
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