病毒感染力的滴定
实验概要
本实验介绍了病毒感染力的滴定（TCID50的测定）。有助于了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
实验原理
半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测
半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
主要试剂
1. 胰酶
2. 生长液
3. 病毒液（PRV）
主要设备
1. 吸球、吸管
2. 96孔细胞培养板
3. 加样器、枪头
实验材料
长满单层的细胞1瓶
实验步骤
1. 在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2. 将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3. 在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4. 设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液 100µl细胞悬液）
5. 逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6. 结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
7. TCID50的计算方法
1) Reed-Muench两氏法
病毒液稀释度 | 出现CPE孔数 | 无CPE孔数 | 累计 | 出现CPE孔所占的% | |
CPE孔数 | 无CPE孔数 | ||||
10-1 | 8 | 0 | 27 | 0 | 100（27/27） |
10-2 | 8 | 0 | 19 | 0 | 100（19/19） |
10-3 | 7 | 1 | 11 | 1 | 91.6 （11/12） |
10-4 | 3 | 5 | 4 | 6 | 40（4/10） |
10-5 | 1 | 7 | 1 | 13 | 0.7（1/14） |
10-6 | 0 | 8 | 0 | 21 | 0（0/21） |
CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差 高于50%病变率的稀释度的对数
=0.8×(-1) (-3)
=-3.8
TCID50=10-3.8/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。
2) Karber法
病毒液稀释度 | 出现CPE的孔数 | 出现CPE孔的比率 |
10-1 | 8 | 8/8=1 |
10-2 | 8 | 8/8=1 |
10-3 | 7 | 7/8=0.875 |
10-4 | 3 | 3/8=0.375 |
10-5 | 1 | 1/8=0.125 |
10-6 | 0 | 0/8=0 |
lgTCID50=L-d(s-0.5)
L：最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)
=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。
