利用微细管蛋白结晶系统(MPCS)进行蛋白质晶体生...（一）
利用微细管蛋白结晶系统(MPCS)进行蛋白质晶体生长的纳升体积优化
Cory J. Gerdts,a,b,c Glenn L. Stahl,a Alberto Napuli,d,e Bart Staker,a,d Jan Abendroth,a,d Thomas E. Edwards,a,d Peter Myler,d,f Wesley Van Voorhis,e Peter Nollertb and Lance J. Stewarta,b,c,d*
MPCS采用基于液滴的微流芯片结晶技术，可以产生纳升体积的用于X射线衍射的蛋白质结晶体。本研究中，使用传统的气象扩散试验获得的29个蛋白结晶，利用MPCS技术的化学梯度优化实验后有28（93%）个成功结晶。总计，通过气象扩散实验中120中蛋白/沉淀剂组合得到的结晶采集数使用MPCS技术有90（75%）可以成功结晶。获得的许多结晶体都有高质量的X射线衍射数据，而且报道了从MPCS CrystalCards收获的6个新蛋白结构。
引言
提高蛋白结晶成功率的重点在于新技术的继续研究和开发(Fox et al., 2008; Ng, Clark et al., 2008; Ng, Stevens & Kuhn, 2008; Li et al., 2009, 2010; Hansen et al., 2002; Cherezov et al., 2008, 2009; Dhouib et al., 2009; Sauter et al.,2007; Hansen & Quake, 2003)。蛋白质结晶体通常很难得到，所以检晶器要尝试使用新的结晶技术，即使是只会使结晶成功率有很小的提高。然而，如果能够证实检晶器的价值，这种新技术也会被广泛的接受。在这一领域里，检晶仪价值的衡量主要通过如何用有限的蛋白量来产生高质量的用于衍射的结晶体和结晶体结构。
ATCG3D （The Accelerated Technologies Center for Gene to 3D Structures）开发了MPCS，他是一项基于液滴的微流体芯片蛋白结晶技术，该技术能够快速而轻松的建立数以百计的batch-under-oil-style结晶 (Gerdts et al., 2008)。MPCS技术独特，因为他能够产生数以百计的纳升体积（10-20nL）的结晶，每一个都包含不同的化学成分（Gerdts et al., 2006; Zheng et al., 2003, 2005）。由于结果是在芯片上形式，所以能够很好的控制一系列的液滴浓度梯度，这可以有效的优化蛋白质结晶体。此外，peel-apart CrystalCards做为MPCS的一部分，主要用于衍射实验前简单的结晶提取。结合这些优势产生的该项技术能够详细的优化结晶体采样数，并且产生的结晶可以直接用于下游的衍射实验。本研究中我们使用SSGCID提供的29个不同的可溶性蛋白检测了MPCS技术对于结晶体优化的能力。
2.研究工作流程
SSGCID是美国国家免疫与传染病研究所（NIAID）资助的两个中心之一，也是四个西北太平洋机构的财团 (Seattle BioMed,Emerald, University of Washington and Battelle)，SSGCID的主要任务是每年确定75-100个新蛋白结构，用于研究NIAID类别中A-C的目标以及新出现的和五年期重新出现的传染病生物。本研究中,SSGCID蛋白质用于检测MPCS使用传统的气象扩散法中悬滴法实验中快速优化蛋白结晶条件的能力。图1显示了研究工作流程。纯化的SSGCID蛋白使用气象扩散法中的悬滴法筛选，与一系列常见的结晶筛选对比(Wizard I, Wizard II,Wizard III, JCSG+ and Precipitant Synergy from Emerald BioSystems, and Crystal Screen HT and Index HT from Hampton Research)。将起初没有得到结晶的去除—与高通量SSGCID结构测定的工作流程是一致的。如果首次筛选的单晶可以用于X射线衍射，在使用MPCS优化前要首先检测衍射质量（这样做是为了避免在结晶体优化时做任何的改善）。蛋白产生的最初的微晶体或单晶不能产生高质量的X射线衍射要使用MPCS优化。因此，本研究中的蛋白检测最初产生结晶采样数但是在其他方面要随机选择。总之，29种蛋白质都要经过MPCS优化。
图1：本研究工作流程图。得到纯化的蛋白并且通过气象扩散实验的悬滴法进行初步的筛选。如果最初得到的结晶体是单晶而且可以收获，那么可以进行X射线衍射分析。如果最初的蛋白质结晶体可以产生高质量的X射线衍射数据则可以不用MPCS优化得到蛋白结构。但是，如果最初的X射线衍射数据不好或者是最初的蛋白质结晶体很小或不能收获，则需要进行MPCS优化。
MPCS优化实验产生的高粒度梯度包含多达400个单独的结晶在20nL的滴状物被称为液滴。大约2µL的剩余蛋白和2µL的沉淀剂溶液（用于初筛）在MPCS CrystalCard内结合（图2a）。与之前或之后的液滴相比每一个液滴形成的浓度都有轻微的不同。这可以通过动力学控制液滴形成溶液的流量来完成。计算机的流量控制产生了各种潜在的梯度。简单来说,只有两种梯度应用于该研究中。这两种类型显示于图2（b）和2（c）。两种MPCS优化类型的目标是仔细询问结晶相空间狭小区域周围的最初的冲击。1型优化保持所有液滴的蛋白浓度而要改变沉淀剂的浓度。2型优化使用不同的蛋白质和沉淀剂浓度，另一面为了检测不同比例的蛋白质和沉淀剂的效果。完成优化实验储存在CrystalCard上，湿度保持在100%用于晶体生长。100%湿度条件下在CrystalCard储存的结晶体液滴可以稳定的保存6个月。此外，尽管在本研究中没有继续研究—在CrystalCard上进行结晶生长期间通过控制存储器湿度液滴能自动脱水。晶体生长后，用于X射线衍射分析，通过剥去薄的塑料粘合层（图2d）并且直接从微细管中收获蛋白质结晶体（图2e）。
图2：（a）最初实验（左）剩余的约2µL的剩余蛋白和2µL的沉淀剂溶液用于MPCS CrystalCard（右）的优化实验。在CrystalCard上，水溶液（蛋白、沉淀剂和buffer）结合并通过惰性的、不能混合的传递液自发的形成独立的液滴。结果，液滴会充满微细管然后用于单独的结晶实验。比例尺=400µm。（b）,（c）蛋白结晶相图，说明在MPCS优化中结晶相空间如何形成，1型MPCS优化中（b）蛋白浓度保持不变而沉淀剂形成一系列浓度梯度。2型MPCS优化中（c）蛋白浓度开始时高随后缓慢的减小而沉淀剂浓度起初低随后缓慢增加，从而产生了一系列液滴的蛋白和沉淀剂的动力学梯度。（d）CrystalCard图片，粘合层被剥离从而使结晶体暴露。比例尺=1inch≈2.54cm。（e）使用0.2mm的cryo-loop从CrystalCard上收获蛋白结晶。比例尺=200µm。
