ChIP常见问题分析与解决办法
本文列出了ChIP实验中常见的问题以及解决办法，供您实验参考！
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问题 |
可能原因 |
解决办法 |
| 非特异性 抗体对照背景高 | 非特异性结合 Protein A 或G beads | 将标本和beads混合孵育1hr后去除，然后再加入 抗体进行反应（包括预纯化标本步骤） |
| ChIP 缓冲液污染了 | 重新配制新的缓冲液 | |
| 有些Protein A or G beads 产生高背景 | 有些Protein A/G beads 产生高背景.尽量使用在非特异性对照中背景很低的Protein A/G beads | |
| 背景高、电泳结果难以分辨大小 | DNA片段太大 | 对不同类型的细胞，DNA 片段化过程要进行优化。破碎后的DNA片段不应该大于1.5 kbp. 如果使用酶消化染色质的话，应该可以看到单个核小体的存在 (175 bp) |
| 信号弱 | 染色质的片段太小了 | 染色质超生破碎的大小不能小于500bp。太小的片段会使的核小体被误认为核小体间的DNA而被消化掉。如果做N-ChIP，酶切反应足够来片段化染色质了 |
| 如做的是X-ChIP,有可能是细胞被交联太久 | 用甲醛交联10-15分钟然后用PBS洗涤。细胞可能需要用甘氨酸处理以去除多余的甲醛.过度的交联会封闭抗原结合表位从而降低抗体的结合 | |
| 染色质用量不足 | 推荐每次实验染色质的用量是25 ug | |
| 免疫沉淀用抗体量不足 | 推荐使用3-5 ug抗体进行初次实验，如果没有信号则可以增加到10ug的用量 | |
| 特异性的抗体结合被清除了 | 洗液中的NaCl 浓度不能高于500 mM ，因为这个浓度过强，有可能会消除特异性的抗体结合 | |
| 细胞没有被完全裂解 | 推荐使用RIPA buffer裂解细胞（参考X-ChIP方法） | |
| 目标区域没有抗体被富集 | 抗体结合表位不存在感兴趣的DNA区域。使用阳性对照抗体，以保证整个操作过程的正确性，如H3K4me3/H3K9me3抗体对应active/inactive promoters | |
| 不适合使用N-ChIP方法 | 当待测蛋白和DNA的结合比较弱或者离DNA比较远时，最好使用X-ChIP。因为交联可以避免在操作过程中蛋白质从DNA上脱落下来。而Histones通常具有很强的DNA亲和力，因此分析时常用N-ChIP | |
| 所选的单克隆抗体可能不适合X-ChIP方法 | 在交联过程中，可能抗体的结合表位被封闭了。推荐使用多克隆抗体，因为具有多个抗原结合表位从而增加了IP靶蛋白的成功率 | |
| 使用了错误的抗体亲和beads | Protein A和G结合不同的Ig. 选择使用能有效结合抗体的Protein beads。推荐使用protein A和G的葡聚糖混合物从而增加沉淀抗体的成功率 | |
| PCR扩增出现问题 | 所有标本包括模板对照 PCR结果信号均过高 | real-time PCR溶液污染了，换用新鲜配制的新溶液重新进行PCR |
| 标本PCR结果阴性 | 使用 standard/input DNA确认引物是否正确 |
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