ImageXpress Micro高内涵3D细胞球成像检测手册（一）
一、概述
1 当前细胞培养和观察的常用方法
十九世纪起，当显微镜出现后，人们就开始尝试对细胞结构进行观察，并在二十世纪发展出细胞的培养技术。单层细胞的培养相对方便，而且商业化的显微镜非常适合于平面的、薄样品的观察，所以，在二十世纪的中后期，人们普遍采用 2D 的细胞培养方法，进行生物学的研究，以及进行药物的筛选、开发和疾病治疗的研究。
2 2D 和 3D 细胞培养及对细胞的影响
通常，2D 细胞培养不但被用来在体外研究不同类型的细胞，还被用来进行药物的筛选和评价等各个方面。这种单层的培养体系使细胞生长于聚酯或玻璃的表面，同时存在的培养液能够给细胞生长提供养分。无数的生物学家通过这种方式极大地推动了生物学和医学进展。
然而，其简单的操作方法也造成了这种模式无法准确的描述和模拟细胞在体内复杂的微环境和各种复杂生物学过程，如细胞信号传递，生化过程或几何学改变。另外通过 2D 细胞培养方法获得的数据应用于体内也会造成一些误导和不可预测性。这些原因促使很多科学家将目标转向了 3D 细胞培养技术，一种在体外能够更加准确描述细胞真实微环境的方法。细胞在体外三维环境下生长产生特殊的生物物理和生物力学信号，这些都会影响到细胞的功能，如细胞迁移、细胞粘附、增殖和基因表达等 ( 如下图 )。
我们知道，有多种不同的 3D 细胞培养方法，不同的方法有着各自的优点和缺点。与 2D 培养不同，3D 细胞培养具有微小结构的形成和复杂的环境特征，能够促进细胞的分化和组织形成。实际上，相比较于生长于 2D 环境，在 3D 环境中细胞能够承受更多的形态学和生理学变化。有研究发现，细胞基底的成分和结构不但能够影响基因表达，还能增强细胞间联系。如有些促进细胞增值的基因在 3D 培养环境下受到抑制，从而不会像 2D 培养下那样无限生长。3D 细胞培养还会促进共培养环境下的两种不同细胞群体的生长，从而能够准确重现组织功能。另外，3D 培养技术能够使细胞微环境参数 ( 温度、化合物浓度、氧气、pH 等 ) 易于控制和监测。
但是 3D 细胞培养技术也有明显的缺陷，这些缺陷还需要技术进步来弥补。首先，一些基质胶会从动物或其他来源吸收一些有害或不需要的物质，如病毒，可溶性因子等，会干扰细胞培养。有些基质具有很好的细胞粘附性，使细胞去除过程更加困难。 另外，3D 细胞培养技术是一种高性价比的技术，能够在药物评价阶段省掉动物药物测试过程，整个流程可实现自动化，可重复性好。
3 3D 细胞技术的延伸和前景
随着 3D 细胞培养技术的发展和成熟，大量的新的相关技术出现，如微流控技术、微器官技术等。这些技术使得培养环境的控制和监测更加容易，同时能够使药物推进临床的速度大大加快，评价结果的可靠性也会大大增加。
二、3D 细胞球培养方法
根据 3D 细胞培养中细胞生长情况，分为两种方法，基于 Scaffold 基质胶的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 细胞培养法和无基质(SCAFFOLD-FREE) 的 3D 细胞培养。
1 基质的类型
基质是3D细胞培养的重要成分，根据不同的培养条件和目的，选择不同的基质。
2 基于 Scaffold 基质胶的 (SCAFFOLD-BASED) 3D 细胞培养法
基质为细胞培养中的细胞提供支撑。细胞能够增殖并迁移进入基质网络内部，最终粘附到基质上。当细胞生长时，成熟细胞相互影响，并最终形成接近于细胞来源组织的微型结构。在大部分情况下，这些细胞会表现为尺寸各异的球形，称为细胞球：这些细胞结构通常用于药物筛选、评价或者其他 3D 细胞的应用。通常，有基质支撑的 3D 细胞培养方法获得的细胞球，由于基质提供了较大的接触面积，其大小会比没有基质支撑的方法获得的细胞球更大。
2.1 基质的种类和成分
根据培养的细胞类型的不同，基质蛋白纤维的特性和形状应与之相配合。基质蛋白纤维的布局应与模拟的器官结构相符，具有类似的结构、尺度和功能。然而，基质纤维越大、结构越复杂，就越难以提取。另外，为了防止任何可能出现的障碍 ( 免疫反应、纤维化、影响生长 )，无论采用何种类型的基质，所采用的基质都必须为细胞生长提供支撑，并具有生物相容性。基质可以是水凝胶，薄膜 ( 或者管状 )，和 3D 基质结构。
2.2 水凝胶基质
凝胶具有很好的力学特征，是最常用的基质。它具有类似于组织的刚性，在某种程度上能够很好地模拟细胞外基质的作用。事实上，就像其他的基质，凝胶这种空洞结构就像一个能够保持营养物质和可溶性因子 ( 如细胞因子、生长因子 ) 的细胞外基质，这些可溶性因子由细胞产生，在凝胶种扩散，使细胞通过非直接接触的方式进行通讯联系。通过这种方法，非常适合于进行微型细胞实体组织的模拟，并在此基础上进行药物的毒性检测和评价等。
包含大量水和天然生物分子 ( 藻酸盐、明胶、透明质酸、琼脂糖、层粘连蛋白、纤维蛋白 ) 都可作为基质。但是其凝胶化基质比较复杂，会使制备和操作非常困难。
合成的和天然的生物聚合物也可作为 3D 培养的凝胶。根据实验条件和最终目的，可找到多种不同的聚合物，包括惰性的和可生物降解的。聚合物易于操作，更适合于构建基质。
其他类型基质：除了水凝胶外，还有很多基质材料可用。非凝胶聚合材料基质常用于组织工程，不同的材料都需要符合所要模拟器官的机械和物理学特征。
3 无基质 (SCAFFOLD-FREE) 的 3D 细胞培养
要形成细胞球，细胞团块即可作为一种很好的生理模块而无需依赖于固体物质的支持。这样获得的细胞球通常比较小，也相对松散。最主要的 scaffold-free 3D 细胞培养法就是 forced-floating ( 强制浮动法 ), hanging drop ( 悬滴法 ) 和 agitation based( 搅动法 )。
forced-floating ( 强制浮动法 ) 是用超低粘附的聚合物包被的多孔板来进行。通过向孔内加入细胞悬液后进行离心获得。
悬滴法是通过将含有细胞的液滴处理，使细胞聚集为紧凑的均一的细胞球。
agitation based ( 搅动法 ) 使用生物反应器获得三维的细胞球结构。
forced-floating ( 强制浮动法 ) 使用简单，并且适合于批量获得，应用广泛。目前市场上有多种不同的产品能够通过该方法，简便快速地获得 3D 细胞球。
3.1 均一化细胞球
均一化细胞球是采用如 Cell-able Oncology 多孔板获得的细胞球。该板采用光刻技术，在多孔板表面光刻获得一致大小的空洞，悬浮细胞可粘附于这些孔内生长成球。
这种方法获得的细胞球大小尺寸均一，一致性好。同时，每个孔内有多个微孔，形成多个细胞球，能够一次获得大量细胞球的结果 ( 相当于重复 )，适合于大通量、规模化检测。
3.2 超低粘附 U 型底多孔板
将细胞悬液加入到超低粘附的 U 型底多孔板内，经过静置培养 2-4 天即可形成形状大小规则均一的细胞球结构。
这种方法操作简便，而且易于放大，耗材便宜，方便进行不同药物的处理，非常适合于药物的毒性评价和药效筛选。
3.3 GravityTRAP 微球法
GravityTRAP 法是利用该耗材的特殊设计，其形式类似于多孔板，但是其底部是一个面积极其限制的一种耗材。该法类似于液滴法，能够获得形态均一的细胞球。但是只适用于部分类型的细胞 ( 见后表 )。
但是该法的操作不太方便 ( 手动加细胞悬液 )、耗材相对较贵，也一定程度限制了其在药物筛选和评价中的作用。
3.4 GravityPlus
GravityPlus 是一种采用悬滴法获得细胞球，将细胞悬液注入孔内，由于液体表面张力，会在孔下方形成倒垂液滴，液滴内细胞由于重力作用逐渐形成细胞球。
3.5 Hanging drop plate
采用响应的重力悬滴多孔板，采用常规的液滴法即可获得均一的细胞球。
三、3D 细胞球的高内涵成像检测技术
根据 3D 细胞球检测的目的的不同，采用不同的成像方法，以此来高效便利地达到实验目的。
1 透射光成像
采用高内涵进行 3D 细胞球的透射光成像是一种常用手段。通过透射光的成像，可以从整体上观察细胞球的形态和大小，可以方便地进行细胞凋亡、生长抑制等方法的检测。借助高内涵的图像分析功能，能够非常简便地实现细胞球的识别、细胞球大小的测定以及细胞球细胞数量的评判。
2 荧光成像
2.1 宽场荧光成像技术
利用宽场荧光成像技术，能够利用各种荧光试剂盒，实现细胞球内细胞凋亡的准确测量和评判，并能够通过抗体标记技术准确测量细胞内的表达。对于宽场荧光成像，由于焦平面图像受到非焦平面的荧光干扰，通常无法获得准确的细胞数量 ( 仅能通过荧光阳性的面积大小进行近似计算 )。另外对于不同 Z 层面的细胞也缺乏分辨能力，造成结果有时有较大偏差。
可同时将宽场荧光成像技术和透射光成像技术结合，从而同时实现以上的功能。
2.2 共聚焦成像技术
采用具有共聚焦功能的高内涵系统，不但能够获得更清晰的细胞球图像，同时还能够获得细胞球内部的图像。通过共聚焦成像，能够获得细胞球内任意层面的图像，可获得非常准确的细胞定量信息，包括细胞数量、细胞凋亡、蛋白表达、蛋白分布等，而不像宽场荧光成像和透射光成像，仅能获得细胞球整体信息。
3 3D 细胞球的分析技术
3.1 3D 细胞球分析的目的和意义
3D 细胞球技术是一种用于生物学研究、药物筛选和药物评价的非常有潜力的技术。由于其能够通量化和规模化，除了新的相关技术用于肿瘤治疗研究外，大部分用于药物的筛选和评价。而对于药物的筛选和评价，通过量化不同干预 / 药物下的细胞球的变化 ( 形态学和功能 ) 都对于药物研究有着重要意义，高准确度、无偏移地对细胞球和细胞球内的细胞进行定量就变得非常重要，这不但会影响药物筛选的结果，对于区分不同 Hit 的药效或作用，尤其是肿瘤个性化治疗效果的体外准确评判，具有非常关键的作用。
